胡建鵬，宋正己，李玉蓮，尋琳婷，趙雪茹，張镕

急性肝損傷（acute liver injury）是指在無慢性肝病基礎(chǔ)上，由多種病因?qū)е赂闻K細(xì)胞損傷，肝臟解毒、生物轉(zhuǎn)化、合成和排泄等功能出現(xiàn)障礙。造成急性肝損傷的原因主要包括病毒感染、休克缺血、食物或藥物中毒、放射線損傷、妊娠、酒精攝入過量以及肝外組織器官功能障礙間接造成肝損傷等。肝臟有著極強(qiáng)的再生和修復(fù)能力，去除急性肝損傷病因后，在短期內(nèi)組織重建即可完成，組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)。Norrie病是一種先天性視網(wǎng)膜血管發(fā)育不全，視網(wǎng)膜血管擴(kuò)張、血管增殖、纖維化和視網(wǎng)膜脫離的疾病，是由Norrin蛋白相關(guān)基因（Ndp）缺陷，正常視網(wǎng)膜血管發(fā)育過程中斷，視網(wǎng)膜處于缺氧狀態(tài)，啟動(dòng)了病理性血管新生而導(dǎo)致的疾病[1，2]。Norrin蛋白是一種小分子的分泌型糖蛋白質(zhì)，能通過自分泌和/或旁分泌方式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管周圍細(xì)胞，決定靶細(xì)胞的移行、增殖和血管網(wǎng)絡(luò)形成等生物行為，在中樞Norrin還有促神經(jīng)生長因子樣作用[3，4]。在Norrin基因缺陷小鼠引入外源性Norrin基因可以恢復(fù)視網(wǎng)膜血管網(wǎng)的形成，并且所形成的視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)，包括超微結(jié)構(gòu)都是正常的，能完全恢復(fù)正常的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和維持視網(wǎng)膜功能[5]。近年國外研究報(bào)道，活化的肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）存在 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活，阻斷該信號(hào)可抑制HSC的活化[6]。已有研究認(rèn)為細(xì)胞外Norrin蛋白通過與細(xì)胞膜上特異性跨膜受體卷曲蛋白4（Frizzled-4）結(jié)合，能介導(dǎo)Norrin/Fri-zzled-4信號(hào)通路，調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程，與血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管周圍細(xì)胞的遷移、增殖和血管網(wǎng)絡(luò)形成相關(guān)。Norrin/Frizzled-4在血管新生（angiogenesis）及發(fā)育過程中起到關(guān)鍵性作用[3，7，8]。近年來，有關(guān) Norrin基因在正常血管發(fā)育中的作用研究已取得突破性進(jìn)展，但Norrin/Frizzled-4信號(hào)在急性肝損傷組織血管新生和肝間質(zhì)重建中的作用還鮮有報(bào)道。本研究采用硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷，觀察了肝組織Norrin/Frizzled-4蛋白、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和CD105表達(dá)的變化及其與肝組織血管新生之間的關(guān)系，以便進(jìn)一步研究Norrin/Friz-zled-4信號(hào)在急性肝損傷間質(zhì)重建中的作用及其調(diào)控途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器 健康SPF級(jí)雄性SD大鼠33只，體質(zhì)量200±20 g，購自成都達(dá)碩生物科技有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（川）2013-24。在云南省中醫(yī)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室無菌動(dòng)物房飼養(yǎng)，適應(yīng)1 w后開始實(shí)驗(yàn)。TAA購自美國Sigma公司；Nycodenz粉劑（挪威 Axis-Shield）；Hanks、D-Hanks、鏈蛋白酶 E（Solarbio）；Collagenase Ⅳ（美國 MP原裝）；DNaseI（Roche）；檢測 VEGF 和 CD105的ELISA試劑盒（R&B公司進(jìn)口分裝），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天）；抗 Norrin和抗 Frizzled-4（Chem Cruz）。熒光顯微鏡、倒置相差顯微鏡（德國萊卡）；超低溫冰箱、小型臺(tái)式離心機(jī)（美國Thermo）；電泳儀、小型Trans-blot轉(zhuǎn)達(dá)印槽組件（美國Bio-rad）；紅外雙色激光成像系統(tǒng)Odyssey Clx（美國 LICOR）；Epoch連續(xù)波長酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek）；漩渦混合儀（上海QT-1）；SW-CJ-2F標(biāo)準(zhǔn)化超凈工作臺(tái)。

1.2 原代肝星狀細(xì)胞的分離 取1只大鼠，正常飼養(yǎng)至450±50 g后，用Hanks液在體灌洗大鼠肝臟，離體后用0.05% Ⅳ型膠原酶、0.02%鏈蛋白酶E和0.05%DNaseI灌注、消化大鼠肝臟，經(jīng)12%Nycodenz密度梯度離心，收集肝星狀細(xì)胞層，洗滌、離心后，提取細(xì)胞總蛋白。

1.3 急性肝損傷動(dòng)物模型的制備 將32只大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組（N組）8只，根據(jù)大鼠體質(zhì)量給予 0.9%生理鹽水5 ml·kg-1·d-1腹腔注射；TAA 誘導(dǎo)模型組（M組）24只，根據(jù)大鼠體質(zhì)量給予TAA 250 mg·kg-1·d-1腹腔注射，1 次 /d，連續(xù)注射 3 天，誘導(dǎo)急性肝損傷。于開始注射TAA后的第10 d和第17 d，分別給予10%水合氯醛麻醉。在N組，處死大鼠4只，在M組，處死6只，取肝組織，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察。

1.4 血清CD105和VEGF水平檢測 麻醉大鼠后開腹，經(jīng)心臟取血，3500 r/m離心15 min，取上清，采用ELISA法檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各樣品CD105和VEGF水平。

1.5 肝組織Norrin和Frizzled-4蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法，取肝右葉最大橫切面處組織100 mg，加入含1%PMSF的RIPA裂解液（增強(qiáng)型，P0013B）1 mL，冰上充分勻漿，離心后取上清。測定蛋白濃度，蛋白定量后計(jì)算各樣品體積，確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致。按4：1的比例加入5×SDS-PAGE Ladding buffer，混勻。沸水浴致蛋白變性10 min，冷卻后，置于-70℃冰箱，待用。配制體積分?jǐn)?shù)為12%SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠，灌膠凝固后，取Marker 8μL，蛋白樣品 25 μL（50μg），依次排序上樣，用恒壓45 v電壓，電泳時(shí)間約30 min，待Marker顯示樣品經(jīng)過濃縮膠后將恒壓調(diào)至60 v，繼續(xù)電泳，確定已將目的蛋白條帶分開，停止電泳。按照轉(zhuǎn)膜夾陰極（黑色面）、1層海綿、2層濾紙、凝膠、PAGE膜、2層濾紙、1層海綿、轉(zhuǎn)膜夾陽極（白色面）的順序，一層層趕走氣泡，夾好固定后，將轉(zhuǎn)膜夾放入轉(zhuǎn)膜槽，放入冰袋，蓋好盒蓋后，置于4℃冰箱，恒壓90 v轉(zhuǎn)膜90 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將目的蛋白條帶剪下，放入用TBST配制的3%牛血清蛋白封閉液中，做好標(biāo)記，置于搖床上，室溫?fù)u晃封閉1～1.5 h。分別加入抗Frizzled-4多克隆抗體（1：200）、抗 Norrin多克隆抗體（1：200）和抗 GAPDH 單克隆抗體（1：2000），搖床上4℃冰箱中孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次 10 min。加入相應(yīng)酶標(biāo)二抗（1：10000），用TBST洗膜3次，每次10 min。提前20 min打開紅外雙色激光成像系統(tǒng)，將膜放入掃描儀內(nèi)，掃描成像。以Norrin/Frizzled-4條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值估計(jì)Norrin/Frizzled-4蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Excel 2007和SPSS 18.0軟件，計(jì)量資料以（±s）表示，采用方差分析及t檢驗(yàn)，P＜0.05為組間存在顯著性差異，P＜0.01為存在非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠生長情況 對(duì)照組大鼠活動(dòng)正常，毛發(fā)光澤，飲食飲水及大小便正常，飼養(yǎng)期間體質(zhì)量穩(wěn)定增加；24只TAA誘導(dǎo)急性肝損傷模型大鼠于開始注射 TAA 后的第 3 d、4 d、5 d、6 d，分別死亡 2只、5只、3只、1只（45.8%）；給藥期間動(dòng)物活動(dòng)減少，食欲不振，嗜睡，毛發(fā)蓬亂無光澤。在注射TAA后體質(zhì)量急速下降，停止注射TAA 2 d后又緩慢上升，但始終低于對(duì)照組。

2.2 各組肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 正常組動(dòng)物肝小葉存在，以中央靜脈為中心，肝索呈放射狀排列、整齊（圖1A）；TAA誘導(dǎo)急性肝損傷1 w，大鼠肝細(xì)胞部分腫脹壞死，細(xì)胞質(zhì)疏松化，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)空泡（圖1B）；TAA誘導(dǎo)急性肝損傷2 w，大鼠肝細(xì)胞腫脹嚴(yán)重，排列紊亂，胞內(nèi)出現(xiàn)大空泡，細(xì)胞核體積變小，有炎性細(xì)胞浸潤（圖1C）。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE，40×）

2.3 血清CD105和VEGF水平比較 與正常對(duì)照組比，急性肝損傷1 w組大鼠血清CD105和VEGF水平顯著升高（P＜0.05），急性肝損傷2 w組大鼠血清CD105和 VEGF 水平極顯著升高（P＜0.01），且 1 w組和2w組比較，血清中VEGF水平也有差異顯著（P＜0.05，表1）。

表1 各組血清CD105和VEGF水平（±s）比較

表1 各組血清CD105和VEGF水平（±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.05，②P＜0.01

只 CD105（ng/mL） VEGF（pg/mL）正常對(duì)照 8 2.175±0.046 61.476±0.388急性肝損傷1 w 13 2.359±0.067① 62.093±0.54急性肝損傷2 w 8 2.421±0.033② 64.520±0.252②

2.4 肝組織Norrin/Frizzled-4蛋白表達(dá)情況 結(jié)果顯示，原代肝星狀細(xì)胞和正常肝組織不表達(dá)Norrin蛋白或Frizzled-4蛋白，或表達(dá)量很低；急性肝損傷1 w和2 w組肝組織Norrin蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2、圖3）。急性肝損傷2 w組Norrin蛋白表達(dá)量顯著低于1 w組（P＜0.05），說明急性肝損傷后肝組織Norrin蛋白表達(dá)逐漸降低。正常大鼠肝組織Frizzled-4蛋白高表達(dá)，提示除HSC外肝臟內(nèi)可能還存在其他間質(zhì)細(xì)胞或?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞參與Frizzled-4蛋白的表達(dá)。急性肝損傷大鼠肝組織Frizzled-4蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖 2、圖 3）。

圖2 各組肝組織Norrin/Frizzled-4蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖3 各組肝組織Norrin/Frizzled-4蛋白表達(dá)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)急性肝損傷大鼠血清CD105和VEGF水平升高，說明肝組織代償性啟動(dòng)血管新生，促進(jìn)肝間質(zhì)重建[9]。在急性肝損傷時(shí)，庫普弗細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞被激活并產(chǎn)生 TGF-β1、PDGF、VEGF、腫瘤壞死因子（TNF）等細(xì)胞因子以及炎性介質(zhì)和活性氧，促使靜止的HSC活化，活化的HSC具有血管平滑肌細(xì)胞特性，能促進(jìn)新生血管的構(gòu)建[10-13]。

經(jīng)典WNT/β-catenin信號(hào)通路是細(xì)胞外配體（WNT蛋白家族）作用于跨膜卷曲蛋白-低密度脂蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合受體（Frizzled/LRP），使Dishevelled蛋白被激活。當(dāng)β-catenin降解復(fù)合體被抑制后，β-catenin信號(hào)得以在胞漿內(nèi)累積并傳導(dǎo)至細(xì)胞核，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF1相互作用，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)[14-16]。Norrin蛋白在結(jié)構(gòu)上和Wnt蛋白無關(guān)，但也是Frizzled-4蛋白在細(xì)胞外的一種配體蛋白，能激活Norrin/Frizzled-4信號(hào)通路。Norrin/Frizzled-4和Wnt/β-catenin信號(hào)通路的協(xié)同分子和靶分子不盡相同[17]，Norrin/Frizzled-4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在血管發(fā)生和功能維護(hù)中起核心作用[3，14]。

本研究結(jié)果顯示，Norrin蛋白在肝星狀細(xì)胞和正常肝組織中表達(dá)量低，損傷初期其表達(dá)量上調(diào)，之后又有所下降。除HSC外，肝臟內(nèi)可能還存在其他間質(zhì)細(xì)胞或?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞參與Frizzled-4蛋白的表達(dá)[18]。文獻(xiàn)報(bào)道Norrin/Frizzled-4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在血管發(fā)生和功能維護(hù)中起核心作用[3，14，19]。我們還觀察到Frizzled4蛋白表達(dá)與CD105和VEGF具有同步性，急性肝損傷均可顯著上調(diào)其表達(dá)量，參與急性肝損傷后的血管新生，推測Norrin/Frizzled4和WNT/β-catenin信號(hào)在肝損傷血管新生和間質(zhì)重建的不同時(shí)期發(fā)揮作用，而且其作用機(jī)制可能是在急性肝損傷后上調(diào)CD105和VEGF表達(dá)，促進(jìn)血管新生和組織修復(fù)。

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