楊 帆 秦一鳴 吳 迪 高德慧 李 婷 高冬梅

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355）

燙傷屬生活中極為常見而復(fù)雜的意外傷害，患者多為Ⅱ度燙傷。中醫(yī)臨床對該病的治療積累了豐富的經(jīng)驗，被認為具有較明顯的優(yōu)勢。地榆大黃散為《新編中醫(yī)外科學(xué)》［1］地榆大黃粉加味制劑，本課題組前期發(fā)現(xiàn)地榆大黃散對大鼠燙傷模型具有較好療效，可有效保護創(chuàng)面、緩解疼痛、消除炎癥［2］。然而地榆大黃類復(fù)方制劑的作用機制一直罕有報道。本研究旨在進一步探索其對淺Ⅱ度燙傷的作用機制，為臨床應(yīng)用提供理論與實驗依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠100只，體質(zhì)量180~220 g，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，動物許可證編號：SCXK（魯）20130001。

1.2 試藥與儀器 地榆大黃散（組成：大黃、地榆、梔子、白蘞、白及、鉛丹、紫草、當(dāng)歸、黃蜀葵）制備方法：適量麻油加熱至沸，入當(dāng)歸、紫草炸至微枯，過濾取油。黃蜀葵花以60%乙醇為溶劑，65℃旋蒸得其提取物［3］。其余藥物磨粉過篩。三組分按比例混勻，加適量蒸餾水調(diào)至生藥含量為0.3 g/g即得。上藥均購自安徽亳州浙皖中藥飲片有限公司。濕潤燒傷膏，汕頭市美寶制藥有限公司。大鼠血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）ELISA檢測試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司，批號：25410123423；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SC-3612型低速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；2 mL玻璃勻漿器，江蘇海門春波生物實驗器材廠；腫瘤壞死因子-α （TNF-α）ELISA檢測試劑盒，美國R&D公司進口分裝；黃嘌呤氧化酶（XOD）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號：20150917；負壓采血管，山東奧賽特醫(yī)療器械有限公司，批號：20150601；EL340i型酶標儀，美國 Biotok 公司；MDF-382E（N）型高速冷凍離心機，日本SANYO電機株式會社；DW-86L500型冰箱，青島澳柯瑪公司。

1.3 模型制備與分組 參照文獻［4］采用經(jīng)典造模方法，大鼠于實驗前24 h以8%硫化鈉背部脫毛，觀察確認無紅腫、破皮等損傷情況［4］。燙傷前腹腔注射10%水合氯醛麻醉，將長寬均為1.5 cm、厚0.2 cm的紗布置于沸水中3 min，取出后迅速緊貼大鼠皮膚3 s后移開，以干紗布拭去多余水分，見其皮膚發(fā)紅，局部水腫，出現(xiàn)散在水皰，即可證明造模成功［5］。每只大鼠在左右體側(cè)同時各操作1次。分組與給藥：將100只大鼠分為模型對照組（18只）、濕潤燒傷膏組（18只）、地榆大黃散高劑量組（18 只）、中劑量組（18 只）、低劑量組（18只）、空白組（10只）。造模后，模型對照組與濕潤燒傷膏組分別予以生理鹽水、濕潤燒傷膏0.1 g/cm2涂抹患處，地榆大黃散高劑量組予以地榆大黃散1.8 g/cm2，地榆大黃散中劑量組、地榆大黃散低劑量組以醫(yī)用淀粉分別稀釋至質(zhì)量濃度為1.0、0.5 g/cm2均勻涂抹患處。用紗布固定，保證每天藥物接觸時間12 h以上。每日換藥1次，連續(xù)14 d?？瞻捉M不予處理。

1.4 標本采集與檢測 1）燙傷組織創(chuàng)面愈合率。分別于造模后第 1、2、3、7、14日 5個時相點，給藥組每組各取3只大鼠，以硫酸紙描記其燙傷組織創(chuàng)面，剪下稱質(zhì)量，以質(zhì)量代替面積，以造模后2 d時創(chuàng)面面積為燙傷面積，創(chuàng)面愈合率=（燙傷面積-各時相點面積）/燙傷面積×100%。2）燙傷創(chuàng)面組織VEGF含量。分別于造模后第 1、2、3、7、14日 5個時相點，給藥組每組各取 3只大鼠，以8%水合氯醛腹腔注射麻醉并清理燙傷創(chuàng)面，取創(chuàng)面全層皮膚，按質(zhì)量比1∶10加入生理鹽水，制成勻漿，4℃以下10000 r/min離心15 min，取上清-80℃保存，按試劑盒說明測定VEGF含量。3）血清TNF-α水平及XOD活力。于造模后第2日采血測定血清TNF-α水平。于造模后第14日采血測定血清XOD活力。每組各取6只大鼠，以8%水合氯醛腹腔注射麻醉，頸靜脈采血，3500 r/min離心15 min取上清，-20℃保存，按試劑盒說明檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組內(nèi)、組間參數(shù)比較采用方差齊性檢驗，單因素ANOVA分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠不同時相點燙傷組織創(chuàng)面愈合率比較見表1。燙傷后，隨時間延續(xù)，各組大鼠創(chuàng)面愈合率逐漸上升。在造模后第3日、第7日，與模型對照組相比，地榆大黃散高、中、低劑量均可明顯升高燙傷大鼠創(chuàng)面愈合率（P＜0.05或 P＜0.01）。

表1 各組大鼠不同時相點創(chuàng)面愈合率比較（%，±s）

表1 各組大鼠不同時相點創(chuàng)面愈合率比較（%，±s）

與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

組 別 n模型對照組 3濕潤燒傷膏組 3地榆大黃散高劑量組 3第1日 第3日 第7日 第1 4日2 1.0 1±4.2 0 3 0.9 8±6.0 0 6 1.5 2±8.5 0 9 0.2 7±5.2 0 2 1.7 6±7.0 0 4 5.2 3±8.6 0** 7 6.9 7±8.3 0** 9 4.2 4±4.0 0 1 8.6 0±5.0 0 4 4.7 8±7.8 0** 8 1.8 4±4.7 0** 9 5.9 1±2.8 0*地榆大黃散中劑量組 3 1 9.8 3±6.1 0 4 5.9 0±8.0 0** 7 9.6 2±8.0 0** 9 3.6 8±2.1 0地榆大黃散低劑量組 3 1 9.4 0±6.8 0 4 2.7 9±1 0.1 0* 7 3.5 8±7.4 0* 9 3.2 9±3.4 0

2.2 各組大鼠燙傷組織VEGF含量比較 見表2。燙傷后，各組大鼠創(chuàng)面VEGF含量呈上升趨勢。在不同時相點，各給藥組大鼠創(chuàng)面VEGF含量相對模型組均有不同程度升高。在造模后第7日，地榆大黃散高劑量組、濕潤燒傷膏組大鼠燙傷組織VEGF含量明顯上升（P＜0.05或P＜0.01）。造模后第14日，各組大鼠創(chuàng)面VEGF含量降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或 P＜0.01）。

表2 各組大鼠不同時相點創(chuàng)面VEGF含量比較（ng/L，±s）

表2 各組大鼠不同時相點創(chuàng)面VEGF含量比較（ng/L，±s）

組 別 n模型對照組 3濕潤燒傷膏組 3地榆大黃散高劑量組 3第7日 第1 4日8 5 6.0 2±1 5 3.6 8 7 4 9.0 9±1 5 0.9 3 1 1 5 1.0 5±1 5 2.3 7*1 0 0 5.9 2±1 8 2.1 2**1 2 0 4.1 6±1 6 3.9 8**9 8 6.3 5±1 4 1.7 6**地榆大黃散中劑量組 3 6 4 0.9 9±2 6 1.3 2 7 3 7.7 9±6 3.4 9 7 7 5.3 6±9 0.6 3 1 0 8 5.8 5±2 6 0.8 9 9 2 1.3 4±8 1.4 4*地榆大黃散低劑量組 3 6 0 1.6 0±1 3 5.8 5 6 4 9.4 2±1 2 3.9 4 7 0 1.4 4±1 5 1.1 2 1 0 0 9.2 2±2 2 3.2 0 9 6 3.7 8±1 3 2.0 5*第1日 第2日 第3日6 0 4.9 3±1 7 8.0 0 6 2 3.2 2±9 4.2 4 6 6 6.2 2±1 3 3.4 1 6 9 8.9 1±2 1 8.7 6 7 4 5.4 5±1 4 1.7 7 7 9 7.7 5±1 9 4.5 7 7 3 1.7 6±1 7 4.2 6 7 7 7.4 8±1 2 0.4 2*8 0 0.5 1±1 5 2.9 5

2.3 各組大鼠血清XOD活力及TNF-α水平比較見表3。燙傷后，各給藥組大鼠血清XOD活力及TNF-α水平呈升高趨勢。在造模后第2日，地榆大黃散高劑量組血清TNF-α水平最低（P＜0.01）。造模后第14日，地榆大黃散高劑量組、濕潤燒傷膏組大鼠血清XOD活力低于模型組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠不同時相點血清XOD活力及TNF-α水平比較（±s）

表3 各組大鼠不同時相點血清XOD活力及TNF-α水平比較（±s）

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3 討 論

中醫(yī)治療湯火燙傷歷史悠久，臨床經(jīng)驗極其豐富，早在《肘后方》《劉涓子鬼遺方》已有湯火灼傷的相關(guān)處方。地榆大黃類制劑是經(jīng)典的臨床治療燒燙傷的外用制劑，能達成快速鎮(zhèn)痛、生肌止血、盡量減少疤痕生成的理想臨床療效。方中大黃、地榆、白蘞清熱涼血，生肌斂瘡；白及質(zhì)黏為賦形劑，且有去腐生肌之效［6］。紫草、當(dāng)歸共入血分，紫草清血分之熱，當(dāng)歸具生肌活血之功?！秲?nèi)經(jīng)》曰“諸痛癢瘡，皆屬于心”，故加梔子仁涼散心火，定痛止血；黃丹少量反佐，化腐生肌。先賢張山雷于《本草正義》中記載：“黃蜀葵花麻油浸，密收，治湯火灼傷……甚有效也”。今用乙醇萃取其有效成分，按諸方比例折算添加，可收其止腐定痛之功。而現(xiàn)代藥理學(xué)亦證明，本方中大黃、地榆、紫草、當(dāng)歸等可促進創(chuàng)面愈合，對病原微生物表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。

對于實驗性燙傷，溫度和持續(xù)時間無疑是最重要的兩個致傷因素。為求研究的可重復(fù)性和對比性，須對這兩個因素加以控制。有些文獻采取高溫砝碼或鐵棒接觸皮膚造模的方法，雖然可以固定面積，然而人為施加壓力并不能保證每次力度均等，必然導(dǎo)致各模型熱力滲透不均，由此造成致傷程度不一，在日后的檢驗尤其是病理切片中常出現(xiàn)誤差。本研究參考文獻［7］，以固定面積和厚度的紗布浸沸水造模，借紗布本身的柔性和重力貼合皮膚，不施加外力，避免了人為因素的干擾。

燙傷后，多種因素共同作用于創(chuàng)面修復(fù)過程，而新生血管的生成在其中起重要作用。VEGF是一種外分泌的同源二聚體糖蛋白，能增強血管通透性，促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、分化和遷移，是血管生成過程中作用最強的因子［8-9］。其密切參與燙傷臨床事件進程，在創(chuàng)面血管修復(fù)過程中起調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，地榆大黃散各劑量均可顯著增加燙傷大鼠組織VEGF含量，說明對VEGF合成與釋放的促進作用可能是地榆大黃散不同程度升高各給藥組大鼠創(chuàng)面VEGF含量的機制。

普遍認為，燙傷后創(chuàng)面愈合程度決定了燙傷的預(yù)后，而炎癥反應(yīng)則是創(chuàng)面修復(fù)的始動環(huán)節(jié)。但過度的炎癥反應(yīng)亦使燙傷創(chuàng)面持續(xù)惡化、壞死，最終導(dǎo)致組織修復(fù)不良［10］。研究證實，TNF-α是傷后最早出現(xiàn)的細胞因子，在炎癥反應(yīng)啟動過程中扮演了關(guān)鍵分子的作用［11］。TNF-α不僅可刺激中性粒細胞的活化，產(chǎn)生毒性產(chǎn)物損傷組織細胞及血管內(nèi)皮細胞，從而導(dǎo)致血管功能紊亂；更可作為炎癥細胞因子網(wǎng)鏈中的第一個細胞因子激活細胞因子級聯(lián)反應(yīng)，進一步誘發(fā)炎癥介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致劇烈的急性炎癥反應(yīng)，致使發(fā)展到嚴重的MODS階段［12］。同時，TNF-α還可增強過氧化物陰離子產(chǎn)生，刺激細胞分泌髓過氧化物酶［13］；而燙傷后創(chuàng)面本就處于缺血缺氧的微循環(huán)障礙狀態(tài)［14］，缺血時黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為XOD，產(chǎn)生大量活性氧（ROS），是燙傷后氧化應(yīng)激損傷的重要途徑［15-16］。且ROS亦可協(xié)同TNF-α等炎癥介質(zhì)進一步對創(chuàng)面及遠端器官造成損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，地榆大黃散各劑量組可于傷后第2日降低燙傷大鼠血清TNF-α含量，顯著抑制血清XOD活力，證實地榆大黃散可通過抑制燙傷局部炎癥反應(yīng)、減輕細胞與器官的氧化損傷而發(fā)揮對燙傷創(chuàng)面的良好保護作用。

綜上所述，地榆大黃散對大鼠淺Ⅱ度燙傷模型有良好的治療作用，其作用可能是通過促進創(chuàng)面VEGF的合成與釋放、降低血清XOD活力及TNF-α含量而實現(xiàn)的。本研究從實驗角度為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。但其具體的作用機制，如是否作用于其它炎癥介質(zhì)、對局部微血管信號通路的影響等，仍有待于深度探索。

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