柯 鴻武倫 王黎

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

急性髓細胞白血?。ˋML）是由來源于骨髓的祖細胞或干細胞惡性轉(zhuǎn)化造成的克隆性血液系統(tǒng)腫瘤，表現(xiàn)為造血祖細胞或干細胞增殖過度、分化障礙或細胞凋亡受抑［1］。目前對AML的治療以化療為主，但化療產(chǎn)生的耐藥性及嚴重不良反應(yīng)限制了它的臨床使用，而造血干細胞移植雖可以治愈大多數(shù)白血病，但受制于骨髓移植源少、費用高昂及手術(shù)死亡率高等諸多不利因素，常達不到治愈目的。而中醫(yī)中藥在治療腫瘤方面有一定的效果，因此，研究傳統(tǒng)中藥治療AML十分必要。臨床常用的中藥淫羊藿為小檗科植物心葉淫羊藿，常用于治療半身不遂、腰酸腿痛、陽痿早泄、四肢麻木、神經(jīng)衰弱、健忘、目眩耳鳴等［2-3］。國內(nèi)外大量研究表明，淫羊藿的主要藥理成分黃酮類生物堿——淫羊藿苷具有抗腫瘤、促進間充質(zhì)干細胞增殖及遷移、抑制腫瘤細胞生長、遷移、侵襲和促細胞凋亡作用［4-6］。在血液系統(tǒng)腫瘤研究中，目前有實驗證實淫羊藿可抑制AML細胞株HL-60的增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡和分化［7-8］。由于細胞增殖與凋亡平衡關(guān)系失調(diào)是AML發(fā)生的根本原因，因此，本研究以AML細胞株HL-60為靶細胞，采用腹腔注射的方法建立AML模型，觀察淫羊藿提取物體內(nèi)對AML細胞株HL-60的抑制作用，為尋找治療AML潛在的有效藥物提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級，SCID小鼠60只，雌雄各半，7~8周齡，體質(zhì)量20~22 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證編號：SCXK（京）2017-019。動物房要求恒溫20~22℃，恒濕60%~70%，5只1籠喂養(yǎng)，自然光照，自由飲純凈水，食料高壓滅菌。

1.2 藥物及試劑 1）淫羊藿提取物的提取。取干燥淫羊藿生藥200 g，加400 mL雙蒸水浸泡1 h，采用加熱提取法得到200 mL水煎劑，制成的生藥水煎提取液置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。淫羊藿提取物由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部提取。阿糖胞苷標準品購自上海源葉生物科技有限公司；AML細胞株HL-60購自上海撫生實業(yè)有限公司；同源性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）、多聚腺苷二磷酸核糖多聚酶（PARP）ELISA試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）；胎牛血清和RPMll640培養(yǎng)液（賽默飛）；環(huán)磷酰胺注射液（上海瀚香生物科技有限公司）；DAB試劑盒和小鼠抗人CD13和CD71單克隆抗體 （北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）。

1.3 細胞培養(yǎng) 取出凍存AML細胞株HL-60的冷凍管速融，37℃解凍，細胞培養(yǎng)箱通5%CO2，恒溫37℃，解凍后HL-60接種于含100 mg/L鏈霉素、100 U/mL青霉素G和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。常規(guī)傳代培養(yǎng)3 d，EDTA消化后注入離心管，1000 r/min低速離心5 min，收集AML細胞株HL-60調(diào)制成細胞數(shù)密度為1×107的細胞懸液備用。

1.4 造模與分組 60只小鼠隨機選取其中的50只，再隨機分為模型組、阿糖胞苷組、觀察1組、2組和3組，另10只正常小鼠設(shè)為空白對照組。將模型組、阿糖胞苷組、觀察1組、2組和3組SCID小鼠移出，在超凈臺上，按100 mg/kg體質(zhì)量的環(huán)磷酰胺腹腔注射預(yù)處理，每日1次，注射2 d，第3日取備用的AML細胞株HL-60細胞懸液，均從小鼠右側(cè)腹部皮下單點注射（1×107/鼠），空白對照組不做處理。注射后第3周以肝脾出現(xiàn)腫瘤浸潤、外周血白細胞達（4.03±1.92）×109/L為成瘤標準［9］。在造模的預(yù)實驗中，平均成瘤時間為（14.63±2.74） d，平均生存時間達（54.36±6.97） d，說明這種方法造模簡單，成瘤率高 （本實驗成瘤率為100%），并能更真實、直觀地觀察白血病細胞在肝、脾、肺等內(nèi)臟器官的浸潤及轉(zhuǎn)移情況。

1.5 給藥方法 注射AML細胞株HL-60細胞懸液后第3周最后1 d，觀察1組、2組和3組分別用淫羊藿提取物，按10、5、2.5 mL/kg灌胃 5周，模型組和空白對照組灌胃等體積0.9%氯化鈉注射液5周。阿糖胞苷組尾靜脈注射阿糖胞苷標準品 100 mg/（m2·d），每日 1次，共治療5 d。

1.6 標本采集與檢測 1）外周血白細胞計數(shù)及分類。在治療結(jié)束時取尾靜脈血0.1 mL，用人工計數(shù)法計數(shù)白細胞、紅細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和HL-60細胞總數(shù)。2）流式細胞分析儀檢測CD13和CD71表達率及細胞各周期細胞百分率。在治療第5周最后1 d，處死小鼠，摘取肝、脾組織，制成組織勻漿細胞懸液，加鼠抗人CD13-PE和CD71-PE，陰性對照加羊抗小鼠IgG-PE標記，4℃下避光染色30 min，PBS液洗2次，按試劑盒操作進行流式細胞學(xué) （FCM）檢測CD13和CD71陽性表達率。取尾靜脈血0.1 mL，用紅細胞裂解液去除紅細胞制成單細胞懸液，用PBS液洗2次，75%乙醇固定，12 h后采用FCM方法上樣進行檢測，并用Cell Quest析軟件分析各組G1和S期HL-60細胞所占百分率。3）Western blotting檢測PTEN和PARP蛋白表達。稱取小鼠脾臟組織約100 mg，剪碎后勻漿，提取總蛋白質(zhì)進行電泳分離。電泳分離時在100 V恒壓下電泳20 min，150 V恒壓下電泳60 min，250 mA下電轉(zhuǎn)膜90 min，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別加入Ⅰ抗兔抗人PTEN和PARP單克隆抗體10 mL，4℃過夜。然后加入生物素化Ⅱ抗，室溫2 h后加ABC復(fù)合物，室溫下消化30 min，再后再加DAB顯色液顯色。以β-actin為內(nèi)參，以目的基因灰度值/β-actin灰度值之比值表示相應(yīng)基因的相對值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示，先進行單因素方差分析，組間差異則采用兩樣本均數(shù)t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠外周血白細胞計數(shù)及分類比較 見表1。FCM檢測顯示，模型組白細胞、淋巴細胞和HL-60細胞總數(shù)升高，中性粒細胞降低，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，阿糖胞苷組白細胞、淋巴細胞和HL-60細胞總數(shù)明顯降低，中性粒細胞升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。觀察2組和觀察3組這一作用與阿糖胞苷組相似，與模型組比較各指標差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組小鼠外周血白細胞計數(shù)及分類比較（±s）

表1 各組小鼠外周血白細胞計數(shù)及分類比較（±s）

與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別 n空白對照組 1 0模型組 1 0阿糖胞苷組 1 0白細胞（1 0 9/L）中性粒細胞（%）淋巴細胞（%）H L-6 0細胞（%）5.0 3±0.2 1 3.5 1±0.2 0 7 0.5 6±5.2 3 0 1 0.2 1±1.6 4* 1.6 9±0.1 1* 8 6.6 4±7.5 1* 1 7.8 2±1.9 6*4.6 7±0.8 6△ 3.0 2±0.2 5△ 6 8.9 4±8.4 3△ 5.4 6±0.7 2△觀察 1組 1 0 9.7 5±1.2 7 1.8 6±0.1 7 8 4.8 6±6.9 7 1 5.1 4±1.7 5觀察 2組 1 0 7.4 8±1.0 4△ 3.4 2±0.1 4△ 7 2.4 2±5.8 4△ 6.3 8±1.0 2△觀察 3組 1 0 5.1 3±0.7 1△ 3.8 6±0.2 2△ 7 3.5 1±7.2 1△ 6.0 6±0.6 5△

2.2 各組小鼠CD13和CD71表達率和HL-60細胞各周期細胞百分率比較 見表2。與空白對照組比較，模型組在治療第5周G1期HL-60細胞百分率明顯降低，CD71和CD13表達率明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，阿糖胞苷組G1期HL-60細胞百分率明顯升高，CD71和CD13表達率和S期HL-60細胞百分率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。觀察2組和觀察3組這一作用與阿糖胞苷組相似，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且觀察2組和觀察3組G1和S期HL-60細胞百分率呈濃度效應(yīng)關(guān)系。

2.3 各組小鼠PTEN和PARP相對表達量比較 見表3。與空白對照組比較，模型組PTEN明顯降低，PARP明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，阿糖胞苷組PTEN明顯升高，PARP明顯降低（P＜0.05）。觀察2組和觀察3組這一作用與阿糖胞苷組相似，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠CD13和CD71表達率和HL-60細胞各周期HL-60細胞百分率比較（%，±s）

表2 各組小鼠CD13和CD71表達率和HL-60細胞各周期HL-60細胞百分率比較（%，±s）

與觀察 2組比較，▲P＜0.05。

組別 n空白對照組 1 0模型組 1 0阿糖胞苷組 1 0 C D 7 1 C D 1 3 G 1期 S期0.2 3±0.0 2 3.7 5±0.2 7 5 0.5 2±3.1 8 3 9.8 4±4.9 5 3.5 9±0.1 3 8.5 7±0.5 4 3 5.9 4±1.9 3 3 7.5 7±3.1 2 0.3 7±0.0 3△ 3.6 9±0.1 3△ 7 8.4 6±6.2 5△ 1 4.8 3±1.9 4△觀察 1 組 1 0 3.0 3±0.2 4 7.9 1±0.7 6*5 2.4 6±3.2 2 3 6.1 5±3.0 4觀察 2 組 1 0 1.5 8±0.1 2△ 5.1 4±0.2 2△ 6 7.4 6±5.8 4△ 2 0.3 4±1.5 7△觀察 3 組 1 0 0.7 1±0.0 5△ 4.0 1±0.1 9△ 7 6.5 3±6.9 1△▲ 1 5.5 2±1.2 1△▲

表3 各組小鼠PTEN和PARP相對表達量比較（±s）

表3 各組小鼠PTEN和PARP相對表達量比較（±s）

組 別 n空白對照組 1 0模型組 1 0阿糖胞苷組 1 0 P T E N P A R P 1.7 1±0.1 6 6.4 1±0.2 4 0.9 2±0.0 7* 9.2 7±1.1 4*1.9 7±0.1 8△ 6.8 3±0.5 4△觀察 1 組 1 0 0.9 5±0.0 6 9.0 2±0.8 5觀察2組 1 0 1.6 8±0.1 1△ 7.9 4±0.7 9△觀察3組 1 0 1.7 3±0.1 5△ 7.3 6±0.8 1△

3 討 論

急性白血?。ˋL）為兒童最常見的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，根據(jù)癌變細胞類型可分為AML和急性淋巴細胞白血?。ˋLL）兩大類。該病屬造血干細胞惡性克隆性疾病，其病理基礎(chǔ)是因異常的幼稚白血病細胞和原始細胞大量增殖并蓄積于骨髓而影響到正常造血功能，并在增殖的同時廣泛浸潤淋巴、肝、脾等臟器，造成嚴重的出血、貧血、浸潤及感染［10］。臨床檢測表明，兒童AML的骨髓標本中PTEN蛋白表達缺失，PTEN屬磷酸酶活性的抑癌基因，在細胞生長信號通路中起重要作用，具有蛋白磷酸酶活性和脂質(zhì)磷酸酶活性，可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制腫瘤細胞的生長、侵襲［11］。

在本研究中，筆者用陽性藥阿糖胞苷組作為陽性對照，發(fā)現(xiàn)淫羊藿提取物有與其相似的藥理作用，這一作用雖弱于阿糖胞苷，但兩者對相關(guān)檢測指標的作用結(jié)果基本一致。在實驗中，模型組PTEN低表達，不能有效抑制腹腔接種的AML細胞株HL-60細胞增殖，這是造成腫瘤細胞無序生長的關(guān)鍵。而觀察2組、3組PTEN蛋白表達量增加，說明適當(dāng)劑量的淫羊藿提取物可提高抑癌基因PTEN表達，從而拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性，達到抑制AML細胞株HL-60細胞在SCID小鼠體內(nèi)生長的作用。PARP存在于真核細胞中，PARP在生理狀態(tài)下保持染色體結(jié)構(gòu)完整性，參與DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，PARP與細胞的分化、癌化和DNA的修復(fù)有關(guān)。在白血病的發(fā)病過程中，過度激活的PARP可產(chǎn)生大量的聚芳酯，PARP上的絲氨酸磷酸化而失去結(jié)合B細胞淋巴瘤/白血病-6基因的能力［12］。模型組PARP高表達，被異常激活的PARP產(chǎn)生大量的聚芳酯，失去結(jié)合B細胞淋巴瘤/白血病-6基因的能力，造成腹腔接種的AML細胞株HL-60細胞無限制性增殖。而觀察2組、3組PARP明顯下降，提示淫羊藿提取物可通過抑制PARP的裂解，阻止PARP磷酸化，從而產(chǎn)生凋亡作用［13-14］，達到抑制HL-60細胞分化和增殖的目的。CD13存在于細胞表面，是檢測AML的重要標志物，CD13陽性表明生存率低，是預(yù)后不良重要標志［15］。CD71也存在于細胞表面，為轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，可通過與其配體轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合而介導(dǎo)細胞內(nèi)鐵的攝取和轉(zhuǎn)運，在一定程度上反映細胞的增殖活性。模型組CD13和CD71表達率均高于空白對照組，刺激其與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，使細胞內(nèi)鐵的攝取和轉(zhuǎn)運激增促使腹腔接種的AML細胞株 HL-60細胞分化、增殖和浸潤。本課題組觀察淫羊藿提取物體內(nèi)對CD13和CD71均有明顯的抑制作用。實驗結(jié)果顯示，觀察2組、3組CD13和CD71陽性表達率均明顯下降，這與朱劍鋒等［16］觀察到淫羊藿通過抑制CD13和CD71表達率而影響K562細胞的誘導(dǎo)分化作用結(jié)果高度一致。另有研究表明，CD71在靜止期的淋巴細胞上不表達，在高分化期則高表達，這與本研究中模型組觀察到的結(jié)果一致，故CD71常被作為AML的重要標志物用于血液腫瘤的診斷及鑒別診斷［17］。本實驗觀察到觀察2組、3組CD13和CD71陽性表達率均明顯下降，因此可以推斷，淫羊藿提取物通過抑制CD13和CD71表達，并在體內(nèi)生長因子和有絲分裂原的刺激下，促使細胞從G0期進入G1期，將處于對數(shù)生長期腫瘤細胞的阻滯于G1期。

眾所周知，所有惡性腫瘤生長的本質(zhì)就是細胞周期調(diào)控紊亂即失控性增殖，目前，在臨床上使用的抗癌藥大多作用于細胞，可使細胞阻滯在S期或G2/M期［18］。大量抗癌中藥及其單體在體外實驗中能夠誘導(dǎo)細胞周期停滯而發(fā)揮抗癌作用［19］。從本實驗結(jié)果來看，觀察2、3組外周血白細胞、淋巴細胞和HL-60細胞總數(shù)明顯降低，中性粒細胞升高，G1期細胞百分率明顯升高，S期細胞百分率明顯降低，這提示淫羊藿提取物將兩組HL-60細胞阻滯于G1期。

綜上所述，淫羊藿提取物有與陽性藥阿糖胞苷相似的藥理作用，在體內(nèi)對急性髓系白血病HL-60細胞株有一定的抑制作用，其機制可能通過下調(diào)CD13和CD71，裂解PARP以誘導(dǎo)急性髓系白血病細胞凋亡，增強PTEN蛋白表達并促使細胞阻滯于G1期，從而發(fā)揮抑制白血病細胞的增殖作用。

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