王瑞明

[摘要] 目的 觀察急腹癥Ⅲ號對呼吸機相關性肺炎模型大鼠小腸形態(tài)的影響，并探討其作用機制。 方法 雄性SD大鼠100只，隨機分為五組：急腹癥Ⅲ號組（VAP模型，急腹癥Ⅲ號灌胃）、谷氨酰胺組（VAP模型，谷氨酰胺顆粒灌胃）、急腹癥Ⅲ號聯(lián)合谷氨酰胺組（VAP模型，急腹癥Ⅲ號及谷氨酰胺顆粒灌胃）、安慰劑組（VAP模型，生理鹽水灌胃）、空白對照組（生理鹽水灌胃）。術后第5天收集尿液，采用L/M（乳果糖/甘露醇法）評價腸黏膜通透性，術后第6天處死大鼠取小腸進行病理檢測。 結果 安慰劑組L/M較空白對照組明顯增大（P<0.01），其余三個干預組與空白對照組相似。安慰劑組小腸絨毛高度、黏膜厚度及全層厚度均低于空白對照組（P<0.01）。三個干預組小腸絨毛高度與空白對照組相似（P>0.05），且均高于安慰劑組（P<0.01），聯(lián)合組絨毛高度高于急腹癥Ⅲ號組及谷氨酰胺組（P<0.01），但急腹癥Ⅲ號組與谷氨酰胺組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。空白組黏膜厚度與急腹癥Ⅲ號組及聯(lián)合組相似（P>0.05），但高于谷氨酰胺組（P<0.05），三個干預組均高于安慰劑組（P<0.01），但三組之間無差異（P>0.05）。聯(lián)合組全層厚度高于安慰劑組（P<0.01），其余組之間無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。 結論 急腹癥Ⅲ號可減少呼吸機相關性肺炎大鼠模型腸黏膜通透性增加，減少小腸黏膜結構的破壞，保護腸黏膜結構。

[關鍵詞] 急腹癥Ⅲ號；呼吸機相關性肺炎；腸道通透性；黏膜結構

[中圖分類號] R259 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）03-0030-04

Effect of acute abdomen No.Ⅲ on small intestine morphology of rats with ventilator-associated pneumonia

WANG Ruiming

Department of Emergency， Hangzhou Hospital of TCM， Hangzhou 310007， China

[Abstract] Objective To observe the effect of acute abdomen No.Ⅲ on small intestine morphology in rats with ventilator-associated pneumonia and to explore its mechanism. Methods A total of 100 male SD rats were randomly divided into 5 groups. Acute abdomen No.Ⅲ group： VAP model， acute abdomen No.Ⅲ gavage； glutamine group： VAP model， glutamine granules gavage； acute abdomen No.Ⅲ combined with glutamine group： VAP model， acute abdomen No.Ⅲ and glutamine granules gavage； placebo group： VAP model， normal saline gavage； blank control group： normal saline gavage. Urine was collected on the 5th day after surgery. L/M （lactulose/mannitol method） was used to evaluate the intestinal mucosal permeability. The rats were sacrificed on the 6th day after surgery to collect the small intestine for pathological examination. Results L/M in placebo group was significantly higher than that in blank control group（P<0.01）， and L/M in the other three intervention groups were similar to that in the blank control group. The small intestine villi height， mucosal thickness and full thickness in the placebo group were all lower than those in the blank control group（P<0.01）. The small intestine villi height in the three intervention groups was similar to that in the blank control group （P>0.05）， and were all higher than that in the placebo group（P<0.01）. The villus height in the combined group was higher than that in the acute abdomen No.Ⅲ group and glutamine group（P<0.01）. However， there was no difference between acute abdomen No.Ⅲ group and glutamine group（P>0.05）. The mucosal thickness in the blank group was similar to that in the acute abdomen No.Ⅲ group and the combined group（P>0.05）， but higher than glutamine group（P<0.05）. The three intervention groups were higher than placebo group（P<0.01）. However， there was no difference between the three groups（P>0.05）. The total thickness in the combined group was higher than that in the placebo group（P<0.01）， there was no statistically significant difference between the other groups（P>0.05）. Conclusion Acute abdomen No.Ⅲ can reduce the increase of intestinal mucosal permeability in rats model with ventilator-associated pneumonia， reduce the destruction of intestinal mucosal structure and protect the structure of intestinal mucosa.

[Key words] Acute abdomen No.Ⅲ； Ventilator-associated pneumonia； Intestinal permeability； Mucosal structures

腸道是機體最大的細菌和毒素庫[1]，多種原因可導致腸道菌群失調，屏障功能破壞，動力喪失，有可能成為呼吸機相關性肺炎（VAP）患者菌血癥來源，最終發(fā)展成為多器官功能障礙綜合征（MODS）[1，2]。祖國醫(yī)學認為肺與大腸相表里，互為絡屬，互相影響，肺氣不降，津不下達，則腑氣不通。大腸實熱，腑氣阻滯，亦可影響肺的宣降。急腹癥Ⅲ號是我院院內制劑，其基本成分為生大黃、川樸、枳殼、丹參、川芎、生山梔、蒲公英，主要根據(jù)《傷寒論》大承氣湯加減化裁而成，具有泄熱通腑，清熱解毒等功效，臨床上多應用于熱瘀所致的腑實證。本研究基于“肺腸表里”理論，旨在觀察院內制劑急腹癥Ⅲ號對呼吸機相關性肺炎大鼠小腸結構的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

100只體重280～320 g的雄性SD大鼠[上海西普爾必凱實驗動物有限公司生產，生產批號：SCXK（滬）2013-0016；實驗動物使用許可證號：浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，SYXK（浙）2013-0184]。

1.2 實驗設備

光學顯微鏡Olympus，石蠟切片機RM2135型，低溫高速離心機Beckman，SX-300S凝膠圖像分析處理系統(tǒng)（上海小源科技有限公司），高效液相色譜儀（美國water公司），精密電子天平（Sartorius公司），電泳儀（Bio-RAD公司），代謝籠等。

1.3 實驗藥品及試劑

（1）急腹癥Ⅲ號（其基本成分為生大黃、川樸、枳殼、丹參，川芎、生山梔、蒲公英等），由杭州市中醫(yī)院制劑室提供（批準文號：浙藥制字Z20100112）。

（2）谷氨酰胺（日本壽制藥株式會社）：等氮量的谷氨酰胺0.3 g/kg每日灌胃。

（3）乳果糖標準品（上海源葉生物科技有限公司）和甘露醇標準品（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.4 VAP造模方法[3]及造模成功的標準[3]

（1）經口氣管插管：用16和18號靜脈套管針制備氣管導管。大鼠麻醉前禁食12 h。用質量分數(shù)20%的烏拉坦腹腔注射麻醉，用消毒小紗布將舌向左外側上方輕輕拉出，頭部盡量向上抬起，同時上下頜分開。在額戴式喉鏡反射光照射下對準聲門旋轉插入自制氣管導管，插入深度為套管針尾部與牙齒平齊。觀察棉絮在氣管導管口的起伏并用聽診器聽雙肺呼吸音以確定導管在氣管內，將氣管導管外層與大鼠上唇縫合固定，連接動物呼吸機控制呼吸。呼吸機參數(shù)設定為；潮氣量（V）12 mL/kg，呼吸頻率70次/min，吸入氧濃度（FiO2）1.0。為防止體位引起的肺不張，每隔30 min行2～3次大V通氣。股靜脈插管，以3～5 mL/h輸入質量分數(shù)為5%的葡萄糖鹽水。

（2）大鼠VAP模型制備：每只大鼠機械通氣24 h（無需使用肌松劑）后，豎起固定板>45°，以微量注射器快速注入0.2 mL 3×108 cfu/L銅綠假單胞菌（PA）菌液和0.55 mL氣體，并保持體位5 min。

（3）造模成功的標準：出現(xiàn)肺炎臨床表現(xiàn)；大鼠肉眼觀察肺葉可見不同程度的融合性出血性病灶；大鼠肺組織光鏡下觀察呈小葉性肺炎特征；外周血和肺泡灌洗液（BALF）細菌學培養(yǎng)陽性。

1.5 分組及給藥方法

將雄性SD大鼠隨機分為五組：（1）急腹癥Ⅲ號組：大鼠VAP模型，每日灌胃急腹癥Ⅲ號2 mL×5 d。（2）谷氨酰胺組：大鼠VAP模型，每日灌胃谷氨酰胺顆粒2 mL×5 d。（3）急腹癥Ⅲ號聯(lián)合谷氨酰胺組（聯(lián)合組）：大鼠VAP模型，灌胃急腹癥Ⅲ號及谷氨酰胺顆粒各2 mL×5 d。（4）安慰劑組：大鼠VAP模型，每日灌胃生理鹽水2 mL×5 d。（5）空白對照組：無特殊處理，每日灌胃生理鹽水2 mL×5 d。

1.6 檢測項目及方法

腸道通透性：術后第5天，經口灌胃乳果糖+甘露醇混合液2 mL，轉代謝籠收集24 h尿液。取10 mL尿液加硫柳汞2 mL置-20℃冰箱保存。用HS色譜工作站對色譜圖形進行積分處理。計算得出L/M（乳果糖/甘露醇）。

腸道形態(tài)學：術后第6天處死大鼠，保持無菌狀態(tài)，在距離屈氏韌帶5 cm處剪取10 cm腸段，用0.1 M磷酸鹽緩沖液沖洗干凈，其中取2 cm用10%甲醛固定，標本經脫水，石蠟包埋，切片進行常規(guī)HE染色，做光鏡檢查。觀察組織病理學變化，以均數(shù)的絨毛高度、黏膜厚度及全層厚度作為測定數(shù)據(jù)。

1.7統(tǒng)計學方法

用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，通透性檢測用單因素方差分析及Dunnetts法進行兩兩比較，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，治療前后比較采取自身對照t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠L/M（乳果糖/甘露醇）比較的單因素方差分析

單因素方差分析結果顯示，術后第5天五組24 h尿液L/M不全相同（F=19.43，P<0.01）（表1）。進一步采用Dunnetts法進行兩兩比較，結果顯示，安慰劑組L/M高于空白對照組（P<0.01），其余三組則與空白對照組相似，均低于安慰劑組（P<0.01）。見表1。

2.2各組大鼠腸道形態(tài)學變化

安慰劑組小腸萎縮明顯，絨毛腫脹破壞嚴重，短而稀疏；黏膜變薄，黏膜下有炎性細胞浸潤，腸腺顯著減少，分布密度顯著降低。安慰劑組黏膜厚度、小腸絨毛高度及全層厚度均低于空白對照組（P<0.01）。絨毛高度：急腹癥Ⅲ號組、谷氨酰胺組及急腹癥Ⅲ號聯(lián)合谷氨酰胺組小腸絨毛高度與空白對照組相似（P>0.05），且均高于安慰劑組（P<0.01），急腹癥Ⅲ號聯(lián)合谷氨酰胺組絨毛高度高于急腹癥Ⅲ號組及谷氨酰胺組（P<0.01），但急腹癥Ⅲ號組與谷氨酰胺組之間無差異（P>0.05）。黏膜厚度：空白組與急腹癥Ⅲ號組、急腹癥Ⅲ號聯(lián)合谷氨酰胺組相似（P>0.05），但高于谷氨酰胺組（P<0.05），急腹癥Ⅲ號組、谷氨酰胺組及急腹癥Ⅲ號聯(lián)合谷氨酰胺組均高于安慰劑組（P<0.01），但三組之間無差異（P>0.05）。全層厚度：急腹癥Ⅲ號聯(lián)合谷氨酰胺組高于安慰劑組（P<0.01），其余各組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

3 討論

呼吸機相關性肺炎（VAP）是指應用機械通氣治療后48 h和停用機械通氣拔除人工氣道48 h內發(fā)生的肺實質的感染性炎癥。呼吸機相關性肺炎的病因和發(fā)病機制較多，腸道菌群的移位及腸功能衰竭對VAP顯得尤為重要[4]。患者病情越重，腸道通透性越高，而通透性增高又加重病情[5]。細菌移位[6]是指胃腸道內寄生菌通過某些通道進入正常無菌組織，如腸系膜淋巴結和其他臟器，其實移位應包括所有微生物及其產物如內毒素等。細菌移位的機制包括腸黏膜屏障的損傷、萎縮及機體免疫功能的下降及腸道菌群失調等[7]。故腸道通透性增高可反映早期腸屏障的損傷[8]，本實驗通過監(jiān)測實驗大鼠尿液中L/M及小腸絨毛高度、黏膜厚度和全層厚度來判斷急腹癥Ⅲ號保護腸黏膜損傷的情況。

中醫(yī)學認為“肺與大腸相表里”。肺與大腸的表里關系主要體現(xiàn)在肺氣的肅降和大腸傳導相互為用的關系。肺氣肅降，氣機條達，布散津液，有利于糟粕的排出，同理大腸傳導正常，糟粕下行，也有利于肺氣的肅降。呼吸機相關性肺炎以腑實證候為多，基于“肺腸表里”理論治療取得了一定的療效[9]。急腹癥Ⅲ號是我院院內制劑，其基本成分為生大黃、川樸、枳殼、丹參、川芎、生山梔、蒲公英等。主要是根據(jù)《傷寒論》大承氣湯加減化裁而成，具有泄熱通腑，清熱解毒等功效，臨床上多應用于熱瘀所致的腑實證。中醫(yī)認為“六腑以通為用”，六腑傳化水谷，需不斷收納、消化、傳導和排泄，虛實更替，宜通而不宜滯，因此通腑法在腑氣不通及胃腸功能受損方面屢有見效。方中大黃為君，苦寒泄熱，祛瘀通便。大黃作為通腑要藥在《神農本草經》中早有記載：“蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷，調中化食，安和五臟”。厚樸、枳殼為臣，行氣除脹，消積導滯，輔以丹參、川芎、生山梔、蒲公英活血祛瘀行氣之功。

現(xiàn)代藥理研究表明大黃制劑能夠明顯促進胃腸蠕動，減輕腸源性內毒素[10]，對腸道的機械屏障、免疫屏障和生物屏障有保護作用[11]。本院院內制劑急腹癥Ⅲ號的藥理研究表明其具有抗凝，抑制血小板黏附、聚集、釋放，擴張血管的作用，保護腸黏膜屏障功能，減少細菌易位，改善腸黏膜微循環(huán)的作用[12]。

谷氨酰胺對危重患者的腸道保護作用已初步得到肯定[13-14]，它可以減輕腸屏障損害，抑制內毒素和細胞因子的產生，防止腸源性感染[15]，抑制小腸黏膜萎縮[16]。小腸絨毛是固有層和上皮共同凸向腸腔形成的葉狀結構，是小腸壁內大量環(huán)形皺襞上的絨毛狀的突起。氨基酸、葡萄糖、無機鹽等的吸收都在小腸絨毛上皮細胞，如果其受損，將影響營養(yǎng)物質的吸收。小腸絨毛高度、黏膜厚度及全層厚度可以直接反映小腸黏膜的損害。在本研究中，我們聯(lián)合使用了谷氨酰胺和急腹癥Ⅲ號，這在過去的研究中尚未有先例。從大量的實驗研究和本實驗研究結果看，谷氨酰胺和急腹癥Ⅲ號具有很多類似的腸道保護作用，但是作用機制不盡相同。谷氨酰胺作為條件必需氨基酸，可以為小腸細胞供能，修復腸黏膜[17]。S-IgA的合成和分泌也離不開谷氨酰胺[18]。最近研究認為谷氨酰胺能上調ZO-1蛋白，該保護作用與抗氧化應激反應有關[19]。而急腹癥Ⅲ號是傳統(tǒng)中藥，其基本成分為生大黃、川樸、枳殼、丹參、川芎、生山梔、蒲公英等。因其為復方制劑，作用靶點較多，藥理作用也比較復雜。研究表明大黃制劑可以增加胃腸蠕動，促進毒素和細菌的排泄，從而對胃腸黏膜起到保護作用；能拮抗TNF-a、IL-6、IL-8和內毒素等炎癥介質[20]。

本實驗通過急腹癥Ⅲ號與谷氨酰胺的對比研究發(fā)現(xiàn)呼吸機相關性肺炎模型增加腸道通透性，破壞了大鼠小腸黏膜結構，表現(xiàn)為小腸萎縮明顯，絨毛腫脹破壞，絨毛短而稀疏，黏膜變薄，黏膜下炎性細胞浸潤。急腹癥Ⅲ號及谷氨酰胺可阻止大鼠小腸黏膜結構的破壞，保護腸黏膜結構，減少細菌移位，早期聯(lián)合谷氨酰胺的機制考慮是谷氨酰胺改善了腸黏膜細胞的饑餓狀態(tài)，保證免疫細胞的增生和免疫球蛋白的生物合成，防止細菌移位及內毒素入血，維持腸道屏障。但是本實驗樣本量較小，需要進一步大樣本的研究證實。

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（收稿日期：2017-10-16）