李艷霞 劉忠玲 劉建明 李桂君

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱，150081)

組織培養(yǎng)以其培養(yǎng)周期短，繁殖系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，成為快速繁殖優(yōu)良苗木的實(shí)用技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)、林業(yè)等領(lǐng)域[1-4]。而莖尖培養(yǎng)技術(shù)是培育無病毒植株、種質(zhì)資源保存、育種以及遺傳轉(zhuǎn)化等研究的有效手段[5-7]。研究表明，影響植物莖尖培養(yǎng)的有關(guān)因子主要有樹種和品種[8]、取材及接種時期[9]、外植體的消毒[10]、培養(yǎng)基、激素[11-13]以及培養(yǎng)條件等。

越橘(Vacciniumvitis-idaeaL.)為杜鵑花科越橘屬小灌木，是近年來新興的小漿果樹種，目前世界上已有眾多的栽培種用于鮮果的生產(chǎn)?？评麪枴甂oralle’是從越橘野生群體中選出的栽培種，果實(shí)為亮紅色，酸甜可口，具有抗氧化、抗衰老、抗?jié)儭⒖寡缀涂沽龅壬砉δ芗八幱脙r值[14]。植株矮化性能好，四季常綠，具有耐瘠薄、耐風(fēng)、抗旱、耐寒性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是難得的、十分珍貴的園林綠化植物資源。李亞東等[15]對‘Koralle’光合作用特性進(jìn)行了研究。吳林等[16]對‘Koralle’的葉片組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察、描述，并測定了葉片、柵欄組織及海綿組織厚度等結(jié)構(gòu)參數(shù)。在組織培養(yǎng)過程中，pH值高低都會影響‘Koralle’的腋芽增殖[17]。盡管國內(nèi)外積累了一些有關(guān)‘Koralle’的研究資料，但迄今為止，尚未見其莖尖快繁的研究報道。因此，本研究以‘Koralle’為試驗(yàn)材料，在不同生長期進(jìn)行取材，對影響莖尖誘導(dǎo)的主要因子進(jìn)行研究，旨在建立其莖尖離體快繁技術(shù)，為獲得大量優(yōu)良苗木提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料為越橘優(yōu)良品種‘Koralle’，該品種是從白俄羅斯引進(jìn)，露地栽培于黑龍江省森林植物園基因保存區(qū)。

取材及消毒處理：分以下幾個時期進(jìn)行取材試驗(yàn)，即取休眠期枝條于溫室內(nèi)水培催芽，滅菌后接種；取新梢生長初期枝條的頂端新萌發(fā)嫩芽，滅菌后接種；取新梢生長中期的頂端嫩枝莖尖，滅菌后接種；取盛花期的枝條頂端莖尖，滅菌后接種；取秋季休眠前的枝條頂端莖尖，滅菌后接種。

取嫩芽放入組培瓶中，滴2滴洗潔精，在自來水下沖洗30 min。在超凈工作臺上，用75%的乙醇溶液消毒(30、40、50 s)，再用無菌水沖洗2次，轉(zhuǎn)到0.1%升汞(2、4、6 min)中滅菌處理，無菌水沖洗2次，再用2%次氯酸鈉溶液處理(1、2、3 min)，無菌水沖洗4次，最后用無菌濾紙吸干表面水分備用。按照正交表L9(34)設(shè)計(jì)成9種不同的處理。將1 cm長莖尖接種到改良的WPM(分別用708 mg·L-1的Ca(NO3)2·4H2O、202 mg·L-1的KNO3代替WPM培養(yǎng)基中的CaCl2和K2SO4)培養(yǎng)基上，每個處理接種6瓶，每瓶5個莖尖，重復(fù)3次。蔗糖20 g·L-1，瓊脂6 g·L-1，pH值5.4，培養(yǎng)溫度為(23±2)℃，光周期為14 h·d-1，光照強(qiáng)度為2 200 lx，以下組培試驗(yàn)條件均與此相同。接種1周后統(tǒng)計(jì)污染率。

培養(yǎng)基、激素對莖尖增殖的影響：分別以MS、WPM、改良的WPM為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中分別添加ZT(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)和GA3(0.1、0.5、1.0 mg·L-1)。按照正交表L9(34)設(shè)計(jì)成9種不同的處理，將莖尖接種到培養(yǎng)基上，30 d后調(diào)查其增殖倍數(shù)和生長情況。

生根、移栽培養(yǎng)：取繼代培養(yǎng)2次的健壯試管苗在溫室中煉苗，3～4 d后成簇取出(帶有愈傷組織)，用清水沖洗基部，去除培養(yǎng)基。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為800 μg·g-1的IBA中浸泡3 min，用消毒的水苔包裹苗，僅露出1/3～1/4頂部，栽到草炭和蛭石基質(zhì)的營養(yǎng)缽誘導(dǎo)生根，用透光的塑料薄膜拱棚保溫保濕，相對濕度控制在85%左右，溫度控制在25 ℃，誘導(dǎo)生根，40 d調(diào)查生根率。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：按下列方法統(tǒng)計(jì)莖尖離體培養(yǎng)污染率、成活率、增殖系數(shù)以及生根率，采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

莖尖污染率=(污染莖尖數(shù)/接種莖尖數(shù))×100%；

莖尖成活率=(莖尖成活數(shù)/接種莖尖數(shù))×100%；

增殖系數(shù)=增殖后的不定芽數(shù)/接種莖尖數(shù)；

生根率=(生根苗數(shù)/移栽苗數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 取材時期對莖尖誘導(dǎo)的影響

由表1可見，從休眠期枝條于溫室內(nèi)水培時期到秋季休眠前期，莖尖污染率呈升高趨勢，而莖尖誘導(dǎo)成活率呈下降趨勢。休眠期枝條于溫室內(nèi)水培時期與其他時期相比有一定差異，莖尖污染率較低，為7.42%，莖尖誘導(dǎo)成活率較高，為84.01%。新梢生長初期莖尖污染率高于休眠期枝條于溫室內(nèi)水培時期，莖尖誘導(dǎo)成活率與休眠期枝條于溫室內(nèi)水培時期無顯著差異，與盛花期、秋季休眠前期差異顯著。新梢生長中期莖尖污染率達(dá)到50.81%，成活率為45.15%。盛花期和秋季休眠前期莖尖污染率較高，分別為87.90%和92.60%，莖尖誘導(dǎo)成活率較低，分別為10.12%和5.22%。由此可見，不同取材時期莖尖污染率和誘導(dǎo)成活率有很大的差異。

對5次取材結(jié)果進(jìn)行評價得出，污染率由低到高依次為休眠期枝條于溫室內(nèi)水培催芽、新梢生長初期、新梢生長中期、盛花期、秋季休眠前期。在休眠期枝條于室溫內(nèi)水培和新稍生長初期取材，莖尖污染率相對較低，誘導(dǎo)成活率較高，這兩個階段為適宜取材時期。

表1 不同取材時期對越橘‘Koralle’莖尖誘導(dǎo)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母表示在P<0.05水平下差異顯著，同列不同大寫字母表示在P<0.01水平下差異極顯著。

2.2 消毒劑和消毒時間對莖尖誘導(dǎo)的影響

由表2可見，莖尖污染率和成活率不同處理間均達(dá)到差異顯著水平。75%乙醇與0.1%升汞、2%次氯酸鈉配合使用時，不同處理時間下，莖尖污染率和莖尖誘導(dǎo)成活率差異較大。9個處理中，處理1污染率最高達(dá)到76.70%，處理3污染率最低為1.11%。成活率最高的是處理2，為84.15%，成活率最低的為處理3，僅為3.33%。綜合考慮，以處理2污染率相對較低，成活率最高，效果最好，即先用75%酒精滅菌30 s，再用0.1%升汞滅菌處理4 min，最后用次氯酸鈉滅菌處理2 min，污染率和成活率分別為5.64%和84.15%。

表2不同消毒劑及消毒時間對越橘‘Koralle’莖尖誘導(dǎo)的影響

處理處理時間75%乙醇/s0.1%升汞/min2%次氯酸鈉/min污染率/%成活率/%13021(76.70±2.78)a (21.75±7.58)cd23042(5.64±0.33)bc(84.15±4.78)a33063(1.11±0.08)d(3.33±2.95)d44022(45.14±5.47)b(52.42±1.58)b54043(2.45±1.27)cd(21.26±3.47)cd64061(1.55±0.14)d(15.93±3.95)cd75023(4.07±0.97)cd(37.53±2.14)b85041(5.05±1.64)bc(75.82±4.88)a95062(1.91±4.14)d(8.88±2.27)cd

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母表示在P<0.05水平下差異顯著。

2.3 培養(yǎng)基、激素組合對莖尖增殖的影響

由表3可見，將莖尖接種到不同處理的培養(yǎng)基上，不同處理間增殖系數(shù)、苗高均存在顯著、極顯著差異。隨著ZT質(zhì)量濃度的升高，增殖系數(shù)呈先增大后減小的趨勢，說明高質(zhì)量濃度的ZT對不定芽的分化有抑制作用；苗高隨著GA3質(zhì)量濃度的升高而增高。9個處理中，增殖系數(shù)最大的是處理8，為4.85，增殖系數(shù)最小的是處理1，為2.06。苗高最高的是處理7，為2.88 cm，生長最慢的是處理1，為1.79 cm。莖尖接種到MS培養(yǎng)基上生長最差，在WPM培養(yǎng)基上生長次之，而在WPM(改良)培養(yǎng)基上生長最好。莖尖在7號培養(yǎng)基上雖然高生長較大，但叢生芽抽長、細(xì)弱；莖尖在9號培養(yǎng)基上生長增殖系數(shù)、苗高都不如8號培養(yǎng)基上的表現(xiàn)。因此從增殖系數(shù)、苗高以及叢生芽生長情況等進(jìn)行綜合評價，8號處理WPM(改良)+1.0 mg·L-1ZT+0.1 mg·L-1GA3為莖尖增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基，增殖系數(shù)為4.85，苗高達(dá)2.74 cm。

表3 不同培養(yǎng)基、激素組合對越橘‘Koralle’莖尖誘導(dǎo)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母表示在P<0.05水平下差異顯著，同列不同大寫字母表示在P<0.01水平下差異極顯著。

2.4 生根與移栽

選取增殖繼代培養(yǎng)2次的健壯試管苗，溫室中煉苗3～4 d后成簇取出(帶有愈傷組織)，在水龍頭下沖洗基部，洗凈培養(yǎng)基。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為800 μg·g-1的IBA中浸泡3 min，用消毒的水苔包裹苗，僅露出1/3～1/4頂部，栽到小營養(yǎng)缽(V(草炭)∶V(蛭石)=2∶1組成的基質(zhì))中誘導(dǎo)生根，用透光的塑料薄膜拱棚保溫保濕，相對濕度控制在85%左右，溫度控制在25 ℃，誘導(dǎo)生根，40 d后生根率達(dá)87.14%，平均根長1.25 cm。

3 結(jié)論與討論

適宜的取材時期是降低莖尖污染率、提高莖尖誘導(dǎo)成活率的重要因素[9]。‘Koralle’在休眠期室內(nèi)水培后萌發(fā)出的嫩芽污染最低，這個階段可顯著降低接種的污染率，提高莖尖誘導(dǎo)成活率，為最適宜取材時期。新梢生長中期、盛花期以及秋季休眠前的枝條頂端莖尖生長放緩，由于長時間暴露在室外，污染嚴(yán)重。因此，接種后不易滅菌，導(dǎo)致污染率較高，另外莖尖頂端分生組織分化相對緩慢，以至于誘導(dǎo)成活率較低，應(yīng)盡量避免這些時期取材。

在莖尖培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基是影響莖尖成活率以及苗木狀態(tài)的主要因素之一，以往用于藍(lán)莓、紅豆越橘、篤斯越橘組培過程中的培養(yǎng)基主要有WPM、WPM(改良)和MS，當(dāng)然，同一屬的不同種以及不同品種對培養(yǎng)基的反應(yīng)有所不同，使用的培養(yǎng)基不能同一而論[10，18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，對于越橘品種‘Koralle’莖尖培養(yǎng)而言，誘導(dǎo)效果由優(yōu)到劣的培養(yǎng)基排列依次為WPM(改良)、WPM、MS。

植物激素是影響莖尖誘導(dǎo)和增殖的關(guān)鍵因子之一，在組織培養(yǎng)中起重要作用[18]。只有選用合適的激素及質(zhì)量濃度，才能獲得理想的結(jié)果。以往對越橘屬不同種及品種的研究顯示，ZT在莖段、葉片增殖培養(yǎng)過程中起著關(guān)鍵的作用[19-20]，且在0.5～2.0 mg·L-1ZT質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，紅豆越橘、篤斯越橘以及不同品種的藍(lán)莓達(dá)到最高增殖系數(shù)時的所需ZT質(zhì)量濃度不同。也有研究表明，當(dāng)ZT質(zhì)量濃度高于0.8 mg·L-1時，會對藍(lán)莓外植體誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生較大影響，高質(zhì)量濃度ZT抑制有效芽形成，導(dǎo)致愈傷組織發(fā)生嚴(yán)重的玻璃化[21]。本研究中適于越橘品種‘Koralle’增殖培養(yǎng)的ZT質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1，當(dāng)ZT質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg·L-1時，增殖系數(shù)降低，但不定芽基部的愈傷組織并未發(fā)生玻璃化現(xiàn)象，這可能因品種的基因型而異。

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