楊麗娜 王月月 孟昭軍 嚴(yán)善春

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

鉛是人、動物及植物的非必需生長元素。隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展和汽車尾氣的大量排放，鉛通過大氣沉降、污水灌溉等方式進(jìn)入土壤并在土壤中富集[1-2]。林木能通過根部從土壤中吸收重金屬，從而降低土壤中重金屬的含量，在重金屬污染防治方面具有明顯的優(yōu)勢[3]。但金屬在植物體內(nèi)積累過多，會對植物產(chǎn)生毒害作用，使植物體內(nèi)的代謝過程發(fā)生紊亂，直接影響植物生長發(fā)育，乃至造成植株死亡[4]。然而，根據(jù)元素防御假說，植物葉片中富集的重金屬能對食葉昆蟲產(chǎn)生直接的毒害作用，從而對昆蟲的生長發(fā)育、生理生化、新陳代謝等方面產(chǎn)生不利的影響[5-6]。

為了抵御包括重金屬在內(nèi)的內(nèi)外源有毒物質(zhì)的毒害作用，昆蟲在體內(nèi)逐漸形成一套有效的解毒機(jī)制，如通過提高羧酸酯酶(CarE)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)等解毒酶的活性[7-8]。CarE主要通過代謝體內(nèi)某些內(nèi)源及外來有害物質(zhì)，使其分解，排出體外，達(dá)到解毒的目的。GSTs參與、催化某些內(nèi)源性或者外來有害物質(zhì)的親電子基團(tuán)與還原性谷胱甘肽的巰基偶聯(lián)，增加其疏水性使其易排出體外，保護(hù)其機(jī)體、減少氧化壓力[9-10]。CarE和GSTs能通過清除昆蟲體內(nèi)由重金屬脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧(ROS)，來幫助昆蟲減弱重金屬對其造成的氧化損傷。

舞毒蛾(Lymantriadispar)屬鱗翅目毒蛾科(Lymantriidae)，是一種雜食性林木葉部害蟲[11]。我國文獻(xiàn)記載舞毒蛾可取食500余種植物，是我國森林、園林、蠶業(yè)、果樹的重要害蟲，給農(nóng)林業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來嚴(yán)重的損失[12]。本研究通過用含Pb飼料飼喂舞毒蛾，研究其在Pb脅迫條件下的生長情況及其解毒酶活性變化，探究重金屬脅迫對林木害蟲發(fā)生趨勢的影響，為重金屬污染地區(qū)的林木蟲害防治提供基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx處理

舞毒蛾卵塊及幼蟲人工飼料購于中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，卵塊已經(jīng)低溫刺激解除滯育。將卵塊用75%乙醇浸泡10 s進(jìn)行消毒后，用蒸餾水沖洗3次，放在濾紙上吸干水分，裝入培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放入人工氣候箱(型號HPG-280HX、哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)中進(jìn)行卵塊孵化。待幼蟲孵化后用人工飼料飼養(yǎng)至2齡，備用。

根據(jù)前期研究結(jié)果，在不同程度的Pb脅迫下，銀中楊葉片中的Pb分別為33、43、48 mg·kg-1。將鉛粉加入人工飼料，使不同處理組飼料中的Pb為33、43、48 mg·kg-1。將剛蛻皮、健康且個體發(fā)育大小一致的舞毒蛾2齡幼蟲饑餓24 h后，依次接入各組飼料中進(jìn)行飼養(yǎng)，每組每天換一次相應(yīng)Pb質(zhì)量分?jǐn)?shù)的飼料，記錄幼蟲的生長發(fā)育情況，直至所有幼蟲化蛹或死亡。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)50頭幼蟲。放在人工氣候箱中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件均為溫度(24±1)℃，相對濕度(60±1)%，光周期16L∶8D。在試驗期間，從各組內(nèi)分別選取蛻皮不超過24 h的3齡、4齡幼蟲，饑餓24 h后置于冰箱中-80 ℃超低溫備用。各組的標(biāo)記代碼為低、中、高，Pb質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為33、43、48 mg·kg-1。對照組為CK，不含Pb。

1.2 蟲酶活性測定方法

1.2.1 酶源制備

CarE和GSTs的酶源制備方法相同。取舞毒蛾3齡幼蟲，每4頭為1個重復(fù)；4齡幼蟲，每3頭為1個重復(fù)。每處理設(shè)3次重復(fù)。將3齡、4齡幼蟲分別置于預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入磷酸緩沖液(0.1 mol·L-1，pH=7)，冰浴條件下勻漿。所得勻漿液置于離心機(jī)中，10 000 r·min-1，4 ℃，離心20 min，取上清液做為酶源。

1.2.2 蛋白質(zhì)質(zhì)量測定

參照Bradford[13]的考馬斯亮藍(lán)G-250染色法對蛋白質(zhì)質(zhì)量進(jìn)行提取和測定。重復(fù)測定3次。準(zhǔn)確吸取測定溶液于試管中，往試管中分別加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250，于25 ℃水浴鍋中放置2 min，之后在595 nm下測定OD值，以牛血清蛋白質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 解毒酶活性測定

參照郭慶龍[14]、魯藝芳[15]和鄢杰明[16]等的方法對CarE和GSTs進(jìn)行提取和酶活測定。重復(fù)測定3次。

CarE酶活性測定：以5 mLα-醋酸萘酯為底物液，加入0.3 mL酶液，水浴振蕩條件下反應(yīng)30 min后，每只試管加入顯色劑各1 mL，室溫下靜置30 min，用紫外分光光度計測定600 nm波長下的OD值。

GSTs酶活性測定：將2.5 mL磷酸緩沖液(pH=7)、0.2 mL谷胱甘肽和0.1 mL CDNB混合后，加入0.1 mL酶液，在25 ℃恒溫水浴20 min。取出后用紫外分光光度計在340 nm波長下測5 min內(nèi)OD變化值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

GSTs酶活(nmol·mg-1·min-1)=(ΔOD340·V)/(ε·L·m)。

式中：ΔOD340表示340 nm處每分鐘光吸收的變化值；V表示酶促反應(yīng)體積；ε表示產(chǎn)物的消光系數(shù)0.009 6 L·μmol-1·cm-1；L表示比色杯的光程(1 cm);m表示酶液中蛋白質(zhì)量(mg)。

CarE酶活(μmol·mg-1·min-1)=n/(m×t)。式中：n表示反應(yīng)時間內(nèi)酶水解α-乙酸萘酯底物生成的α-萘酚的量(μmol)；m表示酶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量(mg)；t表示反應(yīng)時間(min)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用one-way ANOVA進(jìn)行差異顯著性方差分析，以LSD(最小顯著法)在0.05水平下檢驗各組之間數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 含Pb量脅迫對舞毒蛾幼蟲死亡率的影響

取食不同含Pb量飼料后，舞毒蛾幼蟲的死亡率、化蛹率、羽化率、雌雄比例見表1。各處理組舞毒蛾幼蟲死亡率、雌雄比例增加，均顯著高于CK(P<0.05)，化蛹率、羽化率均不同程度的低于CK，死亡率、雌雄比例隨著飼料中Pb質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而不同程度的升高；化蛹率、羽化率則降低，且Pb高、中質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于Pb低質(zhì)量分?jǐn)?shù)和CK(P<0.05)。說明Pb脅迫能造成舞毒蛾幼蟲死亡、雌雄比例增加，化蛹率、羽化率降低，且呈含量依賴性。

表1 Pb脅迫對舞毒蛾幼蟲發(fā)育的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)。同列不同大寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)。

2.2 含Pb量對幼蟲體內(nèi)CarE和GSTs活性的影響

取食不同含Pb量的飼料后，幼蟲體內(nèi)CarE和GSTs活性的變化與Pb的含量相關(guān)(表1)。由表2可知，與對照相比，Pb中質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理組的3、4齡幼蟲體內(nèi)的CarE活性均顯著增加(P<0.05)，GSTs活性也不同程度的升高。而Pb高質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理組的3、4齡幼蟲體內(nèi)的CarE和GSTs活性不同程度的低于CK，且其中4齡幼蟲體內(nèi)的CarE活性與對照差異顯著(P<0.05)。說明舞毒蛾幼蟲在Pb質(zhì)量分?jǐn)?shù)低時，CarE和GSTs能積極響應(yīng)解毒，但在Pb含量高時，CarE和GSTs的解毒能力明顯受到抑制。

表2 Pb脅迫對舞毒蛾幼蟲解毒酶活性的的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)。同列不同大寫字母表示同一齡期不同處理間差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

據(jù)研究報道，當(dāng)昆蟲在體內(nèi)富集較高含量的重金屬(如Pb、Cd、Zn等)時，會對其造成發(fā)育減緩、各齡幼蟲體質(zhì)量以及化蛹率降低、幼蟲死亡率增加等不利影響[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著Pb質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，舞毒蛾幼蟲死亡率增加，化蛹率、羽化率降低，雄性比例增加，其中Pb中、高質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理組的死亡率、化蛹率、羽化率和雌雄比例均與對照差異顯著(P<0.05)。說明Pb脅迫能對舞毒蛾幼蟲產(chǎn)生顯著的毒害作用。

昆蟲在外源有毒物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)時，需要經(jīng)過氧化、還原、水解等多種方式解毒，這些過程需要昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶體系如羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，在不同時間、不同組織內(nèi)參與，共同完成對有毒物質(zhì)的解毒代謝[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，Pb中質(zhì)量分?jǐn)?shù)組中舞毒蛾3、4齡幼蟲CarE活性均顯著增加(P<0.05)，GSTs活性也不同程度的升高；Pb高質(zhì)量分?jǐn)?shù)組3、4齡幼蟲的CarE和GSTs活性均不同程度降低，其中4齡幼蟲的CarE活性降低顯著(P<0.05)。說明舞毒蛾幼蟲在低含量Pb脅迫下，會產(chǎn)生一種“毒物興奮效應(yīng)”，刺激其提高體內(nèi)的CarE和GSTs活性來響應(yīng)對Pb的解毒；但隨著Pb脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高及脅迫時間的延長，舞毒蛾幼蟲會產(chǎn)生一種“毒物抑制效應(yīng)”，抑制解毒酶的活性。Sun et al.[21]研究發(fā)現(xiàn)低含量鎳能激活斜紋夜蛾(Prodenialitura(Fabricius))幼蟲體內(nèi)的CarE酶活性，而高度濃卻使該酶活性受到抑制。張凱等[22]研究發(fā)現(xiàn)取食含有高含量Cu或Cd的樹葉之后，舞毒蛾幼蟲體內(nèi)GSTs活性顯著下降。這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，說明昆蟲體內(nèi)的解毒酶系對重金屬脅迫的響應(yīng)趨勢與脅迫時間及脅迫濃度密切相關(guān)。

[1] 黃周滿,湯璐,尹春燕.土壤和植物中鉛含量測定及分析[J].工業(yè)安全與環(huán)保,2016,42(8):96-98.

[2] 王宏鑌,束文圣,藍(lán)崇鈺.重金屬污染生態(tài)學(xué)研究現(xiàn)狀與展望[J].生態(tài)學(xué)報,2005,25(3):596-605.

[3] 王明靜.簡析食物和飲用水中重金屬的危害及檢測方法[J].食品安全導(dǎo)刊,2011,29(1):54-55.

[4] 李秀珍,李彬.重金屬對植物生長發(fā)育及其品質(zhì)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,29(14):5742-5746.

[5] KAZEMI-DINAN A, THOMASCHKY S, STEIN R J, et al. Zinc and cadmium hyperaccumulation act as deterrents towards specialist herbivores and impede the performance of a generalist herbivore[J]. New Phytologist,2014,202(2):628-39.

[6] RASCIO N, NAVARI-IZZO F. Heavy metal hyperaccumulating plants: How and why do they do it? And what makes them so interesting?[J]. Plant Science,2011,180(2):169-181.

[7] 胡蒙蒙,王青,楊益眾.重金屬在昆蟲體內(nèi)的累積、分布與排泄[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2012,28(18):213-217.

[8] 劉耀明,楊慧敏,張育平,等.鎘和鉻急性染毒對中華稻蝗解毒酶及多酚氧化酶的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2013,32(7):1321-1327.

[9] 李艷梅,袁紅霞,徐旭,等.重金屬鉛暴露對家蠶組織GSTs和GSH-Px酶活力及基因表達(dá)的影響[J].蠶業(yè)科學(xué),2011,37(3):425-434.

[10] 楊海靈,聶力嘉,朱圣庚,等.谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J].成都大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2006,25(1):19-24.

[11] ENAYATI A A, RANSON H, HEMINGWAY J. Insect glutathione transferases and insecticide resistance[J]. Insect Molecular Biology,2005,14(1):3-8.

[12] 方三陽.森林昆蟲學(xué)[M].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)出版社,1988:121-125.

[13] BRADFORD M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry,1976,72(1/2):248-254.

[14] 郭慶龍.棉鈴蟲對4種殺蟲劑的抗性現(xiàn)狀及Bt棉對棉鈴蟲抗藥性的影響[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[15] 魯藝芳,嚴(yán)俊鑫,李霜雯,等.不同光照強(qiáng)度下興安落葉松對舞毒蛾幼蟲生長發(fā)育及防御酶的影響[J].生態(tài)學(xué)報,2013,33(22):7125-7131.

[16] 鄢杰明,廖月枝,嚴(yán)善春,等.甲氧蟲酰肼對舞毒蛾解毒酶和保護(hù)酶活性的影響[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2010,38(11):112-114.

[17] NURSITA A I, SINGH B, LEES E. The effects of cadmium, copper, lead, and zinc on the growth and reproduction ofProisotomaminutaTullberg (Collembola)[J]. Ecotoxicology Environmental Safety,2005,60(3):306-314.

[18] SHU Y H, ZHOU J L, LU K, et al. Response of the common cutwormSpodopteraliturato lead stress: changes in sex ratio, Pb accumulations, midgut cell ultrastructure[J]. Chemosphere,2015,139:441-451.

[19] 陳巧云,姜家良,林國芳,等.淡色庫蚊對敵百蟲抗性的研究：水解酶同敵百蟲抗性關(guān)系[J].昆蟲學(xué)報,1980,23(4):350-357.

[20] 宗靜,張帆,孫光芝,等.繁殖寄主對赤眼蜂羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶的影響[J].昆蟲學(xué)報,2000,43(增刊):70-76.

[21] SUN H X, ZHOU Q, TANG W C, et al. Effects of dietary nickel on detoxification enzyme activities in the midgut ofSpodopteralituraFabricius larvae[J]. Science Bulletin,2008,53(21):3324-3330.

[22] 張凱,周艷濤,王皙瑋,等.銅、鎘脅迫對舞毒蛾排毒代謝酶的影響[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,38(2):61-67.