霍璐陽 李志國 劉晴 劉宇彤 董愛榮

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

化學(xué)農(nóng)藥中高毒、高殘留、難降解的農(nóng)藥是重要的環(huán)境污染物，不僅污染土壤環(huán)境和農(nóng)作物，而且還進(jìn)一步污染到地面水體和地下水以及海洋環(huán)境，直接威脅著人類的生存環(huán)境和身體健康。長期持續(xù)使用化學(xué)農(nóng)藥，會對環(huán)境和生物產(chǎn)生危害，而且由于耐藥性的產(chǎn)生防治效果逐漸減弱，農(nóng)藥的殘留也給生態(tài)環(huán)境帶來許多負(fù)面影響[1]。

土壤酶是土壤的重要組成部分，參與土壤中所有的生化反應(yīng)，在物質(zhì)轉(zhuǎn)化、能量代謝、污染土壤修復(fù)等過程中發(fā)揮著重要作用[2]。土壤酶是存在于土壤中的生物催化劑，土壤中所進(jìn)行的一切生物化學(xué)過程都要經(jīng)過酶的催化才能完成。土壤酶活性不僅是土壤理化性質(zhì)的具體反應(yīng)，而且還是土壤生物活性的重要體現(xiàn)。由于土壤酶的種類繁多，其單一酶活性也只能夠反應(yīng)土壤中某種特定生物化學(xué)及養(yǎng)分循環(huán)的過程[3]。一般情況下，土壤各養(yǎng)分含量與土壤酶活性之間有較好的相關(guān)關(guān)系[4]。脲酶作用是極為專性的，它能水解土壤中的尿素，生成氨、二氧化碳和水。土壤脲酶活泩的測定方法較多[5]，常用的方法有比色法、擴(kuò)散法和電極法等。邱莉萍等[6]研究表明，土壤中脲酶與磷酸酶活性的大小受土壤的理化性質(zhì)和其他酶活性的影響。近年來，隨著土壤酶活性研究方法及技術(shù)的不斷更新，加之與其他學(xué)科的交叉與整合，不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)，土壤酶具有評價土壤肥力[7]、診斷土壤污染[8]、評價土壤質(zhì)量[9]、培肥土壤[10]及防治植物病蟲害[11]等方面的功能。土壤脲酶活性可以表征土壤氮素的狀況，通過測定各時期脲酶活性的變化，研究短密木霉、大豆與咪唑乙煙酸與脲酶之間的相關(guān)性，為咪唑乙煙酸的酶促降解提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

盆栽模擬試驗土壤為m(草炭)∶m(沙子)∶m(土)=5∶3∶2的比例進(jìn)行混合所得。大豆品種是黑農(nóng)48，菌種是試驗前期馴化得到的高效降解菌株短密木霉(Trichodermabrevicompactum)。

培養(yǎng)真菌的培養(yǎng)基采用孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g、葡萄糖10.0 g、磷酸二氫鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂20.0 g、1/3 000孟加拉紅溶液100 mL、蒸餾水1 000 mL、氯霉素0.1 g。

保存菌株采用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗方法

將短密木霉接種于60個PDA平板中，放入培養(yǎng)箱，25 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)5 d。待菌株大量產(chǎn)孢后，將菌絲連同孢子刮下，加入到盛有無菌水的燒杯中，放入少量的吐溫80，用玻璃棒充分的攪拌，均勻地混入部分試驗用土壤中。再將部分試驗用土壤加入不等量的5%咪唑乙煙酸水劑，分別制成咪唑乙煙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50、100、150 mg·kg-1的污染土。選擇籽粒飽滿、均勻、無病蟲的大豆種子，每盆擺15粒，覆土2.0 cm，放在盆栽內(nèi)自然生長。

按表1設(shè)計盆栽試驗，每個試驗組設(shè)置3個重復(fù)，種植于東北林業(yè)大學(xué)溫室大棚中。盆栽處理后5、10、20、30、40 d分別用五點法取土樣，風(fēng)干，過10目篩，放入冰箱4 ℃保存待用。

表1 盆栽試驗處理組合

1.3 土壤脲酶活性測定方法

采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法[12]測定土壤脲酶活性。脲酶活性以24 h后1.0 g土壤中NH3-N的毫克數(shù)表示。

m(NH3-N)=2a。

(1)

式中：a為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的NH3-N質(zhì)量(mg)；2為換算成1.0 g土的系數(shù)。

每處理組設(shè)3組重復(fù)，并設(shè)無土對照和無基質(zhì)對照組。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在測定樣品吸光值之前，分別取0、1、3、5、7、9、11、13 mL氮工作液，移于50 mL容量瓶中，然后補(bǔ)加蒸餾水至20 mL，再加入4 mL苯酚鈉溶液和3 mL次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20 min后顯色，定容。1 h內(nèi)在分光光度計上于578 nm波長處比色。然后以氮工作液濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

比色法測定土壤脲酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線

y=0.038 4x-0.003 9(R2=0.997 9)。

(2)

式中：x為氮工作液濃度，y為吸光度。

脲酶抑制(激活)率=((d-c)/c)×100%。

(3)

式中：c為空白對照處理的脲酶活性；d為農(nóng)藥處理的脲酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)的整理采用Excel軟件完成；差異顯著性測驗采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 短密木霉對土壤脲酶活性的影響

由表2可知，在土壤中加入短密木霉后，土壤脲酶活性呈現(xiàn)出抑制—恢復(fù)—激活的趨勢。在培養(yǎng)期間，A5與CK的脲酶活性差異性顯著(P<0.05)。土壤脲酶活性5 d時有所下降，但從10 d起有顯著的激活趨勢，20 d時基本恢復(fù)到對照水平。脲酶活性到30 d后呈現(xiàn)激活狀態(tài)直到試驗結(jié)束。脲酶活性是表征土壤供氮能力的重要指標(biāo)。處理30 d土壤氮素水平最高，激活率最高，達(dá)到31.13%。這可能是由于土壤中微生物死亡，細(xì)胞中的脲酶被釋放到土壤中，增強(qiáng)了土壤脲酶的活性。

表2 不同處理對土壤脲酶活性的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；采用鄧肯氏多重比較試驗分析，同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.2 種植大豆對土壤脲酶活性的影響

由表2得知，種植大豆后，土壤脲酶活性呈現(xiàn)出抑制—恢復(fù)—激活的趨勢。在培養(yǎng)期間，A4組與CK對照組的脲酶活性均差異性顯著(P<0.05)。種植大豆5 d時抑制率達(dá)到最高,為10.35%，10～20 d逐漸恢復(fù)到對照組水平。30 d后土壤脲酶活性被激活，直到試驗結(jié)束，有明顯的差異性。

2.3 咪唑乙煙酸對土壤脲酶活性的影響

由表2可知，當(dāng)土壤中咪唑乙煙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50、100、150 mg·kg-1時，土壤脲酶活性呈現(xiàn)出抑制—激活的趨勢，土壤中脲酶活性隨著咪唑乙煙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高抑制率也在逐漸升高，在5～10 d脲酶活性被顯著抑制，A8組10 d抑制率最高，為16.18%。30 d后呈現(xiàn)激活效應(yīng)并持續(xù)到試驗結(jié)束，在30 d時A7組激活率最高，達(dá)到85.23%；除A8組10 d脲酶活性外，其他脲酶活性均與CK對照組有明顯的差異性。

2.4 協(xié)同作用對土壤脲酶活性的影響

由表2可知，在土壤中種植大豆、加入短密木霉之后，再分別加入50、100、150 mg·kg-1的咪唑乙煙酸，土壤脲酶基本呈現(xiàn)抑制—恢復(fù)—抑制—激活的趨勢。5 d時加入50 mg·kg-1的A1組脲酶抑制率最高，達(dá)到38.42%，10 d逐漸恢復(fù)到水平對照，30 d后呈現(xiàn)激活狀態(tài)一直到試驗結(jié)束。30 d激活率最高，達(dá)到29.29%。在加入50、100 mg·kg-1咪唑乙煙酸的對照組中，5 d時脲酶活性被抑制。而加入150 mg·kg-1的處理組卻與對照組基本持平，不加短密木霉的土壤脲酶活性變化很大，而種植大豆后的土壤脲酶活性基本無變化，這可能與大豆的固氮作用有關(guān)。短密木霉對咪唑乙煙酸有一定的降解作用，在土壤中同時加入二者后，相當(dāng)于模擬了大豆田的基本模式，咪唑乙煙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，脲酶受到的抑制作用也就越強(qiáng)，但當(dāng)咪唑乙煙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為150 mg·kg-1時，土壤脲酶的活性卻高于在土壤中加入100 mg·kg-1的咪唑乙煙酸，可能是由于咪唑乙煙酸的淋溶作用。脲酶是對尿素轉(zhuǎn)化起關(guān)鍵作用的酶類，脲酶活性越低，說明這時土壤中的供氮能力越弱。

3 結(jié)論與討論

本研究表明：當(dāng)土壤中咪唑乙煙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50、100、150 mg·kg-1時，5～10 d脲酶活性被抑制，20～40 d時又被激活，該結(jié)果與張清明等[13]報道的氟磺胺醚100、500 μg·kg-1的處理對土壤脲酶的作用趨勢一致。在種植大豆后，加入50、100 mg·kg-1的咪唑乙煙酸的A1、A2組呈現(xiàn)抑制—激活—抑制的趨勢，該結(jié)果與王鑫宏等[14]報道的氯嘧磺隆在土壤中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12～48 μg·g-1時對土壤脲酶的影響結(jié)果一致。咪唑乙煙酸屬咪唑啉酮類除草劑即支鏈氨基酸生物合成抑制劑，大豆可將其代謝，所以種植大豆后并加入咪唑乙煙酸的脲酶活性要比未種植大豆的高，也說明咪唑乙煙酸對脲酶在一定程度上有抑制作用。脲酶活性是表征土壤供氮能力的重要指標(biāo)。在土壤中加入短密木霉后，30 d土壤脲酶活性最高，土壤氮素水平最高，有可能由于土壤中微生物死亡，細(xì)胞中的脲酶被釋放到土壤中，增強(qiáng)了土壤脲酶的活性。大豆的生長隨著咪唑乙煙酸添加的毫克數(shù)的增加，受到的抑制力就越大。

[1] CASIDA J E. Pest toxicology: the primary mechanisms of pesticide action[J]. Chem Res Toxicol,2009,22(4):609-619.

[2] 張麗莉,陳利軍,劉桂芬,等.污染土壤的酶學(xué)修復(fù)研究進(jìn)展[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2003，14(12):2342-2346.

[3] 陳恩風(fēng),周禮愷,邱鳳瓊,等.土壤肥力實質(zhì)研究[J].土壤學(xué)報,1985,22(2):113-119．

[4] 薛冬,姚槐應(yīng),黃昌勇.植茶年齡對茶園土壤微生物特性及酶活性的影響[J].水土保持學(xué)報,2005,19(2):84-87.

[5] 關(guān)松蔭.土壤酶與土壤肥力[J].土壤通報,1980,11(6):41-44.

[6] 邱莉萍,劉軍,王益權(quán),等.長期施肥土壤中酶活性的剖面分布及其動力學(xué)特征研究[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報,2005,11(6):737-741,749.

[7] 陳少杰，鄧恩.桉林地土壤酶活性與土壤養(yǎng)分關(guān)系研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報,2009,15(15):171-172,183.

[8] 孫彩霞,陳利軍,武志杰.Bt殺蟲晶體蛋白的土壤殘留及其對土壤磷酸酶活性的影響[J].土壤學(xué)報,2004,41(5):761-766.

[9] 畢淑芹,張麗娟,賀曉敏,等.坡地土壤酶流失規(guī)律初探[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2006,22(7):500-503.

[10] 鄭銀俠,馬飛明,曹萬虎,等.有機(jī)生物肥料對冬小麥生長及產(chǎn)量影響的研究[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,52(1):22-23.

[11] 楊萬勤,王開運.森林土壤酶的研究進(jìn)展[J].林業(yè)科學(xué),2004,40(2):152-159.

[12] 關(guān)松蔭．土壤酶及其研究法[M]．北京:農(nóng)業(yè)出版社，1986．

[13] 張清明．除草劑氟磺胺草醚對土壤酶、微生物與蚯蚓的生態(tài)毒理研究[D]．泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012．

[14] 王鑫宏,許艷秋,鄧鐵柱,等.氯嘧磺隆對三種土壤酶活性的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2005,24(增刊):70-72.