秦艷芳，吳 昊

（1.長治學院師范分院，山西 長治 046000；2.山西師范大學化學與材料科學學院，山西 臨汾 041004）

引言

在魚、蝦、蟹等海產(chǎn)品養(yǎng)殖期間，需要投放磺胺類藥物來對細菌感染性疾病進行預防與治療，磺胺類藥物不僅能夠達到良好的抗菌效果，其自身還具備價格低、毒性少的優(yōu)勢。不過，當磺胺類藥物達到一定濃度時，仍會對人體健康造成損害，進而影響人體的造血功能，引發(fā)溶血性貧血，特別是其中磺胺二甲基嘧啶等物質，還會有潛在的致癌危險。因此，需要建立高效的測定方法來對磺胺類藥物殘留進行測定。當前，我國對磺胺類藥物的測定方法最常見的有氣相色譜法、免疫測定法、液相色譜法及氣-質聯(lián)用法等。不過，這些測定方法往往只能對其中的幾種磺胺類藥物進行檢測，而磺胺類藥物的種類光是較為常見的就有幾十種，再加上其他種類甚至多達數(shù)千種，因此僅僅依靠這些測定方法難以適用于對磺胺類藥物的測定。為此，本文提出了一種超高效的檢測方法，即液相色譜-串聯(lián)質譜法來對磺胺類藥物殘留進行測定，它不僅靈敏度高，還能對獲得較高的回收率。本文便對這一測定方法進行分析，以此明確這種測定方法的應用優(yōu)勢。

一、測定準備工作

（一）測定材料及磺胺類藥物的種類

本次測定所選取的材料是以海產(chǎn)品中較為典型的日本對蝦、大菱鲆及三疣梭子蟹進行磺胺類藥物殘留的測定，這些測定材料均為市場購買，其余測定材料還包括試劑與超純水，測定試劑包括乙酸乙酯、乙酸銨、甲醇及甲酸，其中乙酸銨為優(yōu)級純，而甲酸試劑則為色譜純。本次測定中，液相色譜-串聯(lián)質譜法需要對21種磺胺類藥物殘留進行測定，這21種測定磺胺類藥物的種類包括：磺胺、磺胺噻唑、磺胺二甲基異惡唑、磺胺硝苯、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺醋酰、磺胺氯噠嗪、甲氧芐氨嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺二甲異嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺胍、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧嗪噠。

（二）測定儀器

該測定方法所選用的儀器有液相色譜-串聯(lián)質譜儀、超聲波清洗器、超純水儀、旋轉蒸發(fā)儀、氮吹儀及高速離心機。

（三）測定條件

液相色譜-串聯(lián)質譜需要調整色譜與質譜，以此建立良好的測定條件，色譜條件包括對色譜柱的調整、流動相的調整、流速的調整、柱溫的調整、進樣量的調整及梯度洗脫程序的設定。色譜柱的寬度為2.1mm，長度為100mm，測定精度為1.7μm；流動相調整為每升乙酸銨溶液包含5摩爾0.1%體積分數(shù)的甲酸；流速調整至0.25mL/min，柱溫調整到35℃，進樣量調整至10μL；梯度洗脫程序的設定應根據(jù)測定時間來對甲醇體積分數(shù)、乙酸銨溶液體積分數(shù)、梯度變化曲線進行調整，如圖1所示。

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質譜條件包括對電離方式及電壓的調整、離子源溫度的調整、脫溶劑氣溫度的調整、脫溶劑氣流量的調整、錐孔反吹氣流量的調整及其他參數(shù)的調整。其中，電離方式設定為ESI+；電離電壓設定為2.8千伏；離子源溫度設定為110攝氏度；脫溶劑氣溫度設定為350攝氏度、氣流量為700升每小時；錐孔反吹氣流量設定為50升每小時；其他參數(shù)的調整如圖2所示。

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（四）測定樣品及溶液的配置

1、樣品處理

在對這21種磺胺類藥品進行進行測定之前，應先對樣品進行處理，首先，我們需要將測定樣品各稱取5克放置到容積為50毫升的離心管當中，并在離心管中放入15毫升的乙酸乙酯溶液，然后將其置于超聲波清洗器中處理1分鐘，取出后放入5克經(jīng)過灼燒處理以后的無水硫酸鈉并搖晃均勻，然后用超聲提取10分鐘，將其放入高速離心機中以每分鐘7000轉的速度處理5分鐘，取出后把調制好的乙酸乙酯溶液進行合并，并放入旋轉蒸發(fā)儀中進行減壓濃縮，取出后摻入1毫升的甲醇與2毫升體積分數(shù)為1%的乙酸溶液對樣品進行溶解，以此實現(xiàn)對樣品的提取。樣品提取后，將樣品提取液放到到小柱當中，然后安裝固相萃取裝置、機械泵，并將SPE裝置與HLB柱進行連接后對樣品提取液進行萃取，需要注意的是，流速應不超過2毫升每分鐘，然后采用2毫升體積分數(shù)為5%的甲醇溶液對小柱進行淋洗，再采用10毫升的甲醇試劑進行洗脫，此時，流速應不超過2毫升每分鐘，然后對洗脫液進行收集，將其放入氮吹儀中用35℃的水浴氮氣對洗脫液進行吹干。吹干后用1毫升流動相定容，并放入0.2微米的濾膜來對溶液進行過濾，以此實現(xiàn)對樣品的凈化，凈化以后方能對樣品進行液相色譜-串聯(lián)質譜測定。

2、儲備液、中間液及工作液的配置

在進行液相色譜-串聯(lián)質譜測定之前，需要提前稱取磺胺類藥品各0.01克，然后用甲醇試劑對藥品進行溶解，使其配置成為濃度為100毫克每升的儲備液，并放入到冰箱中進行儲存。中間液的配置需要利用甲醇試劑來配置為磺胺類藥物濃度為10毫克每升的溶液。工作液的配置應分別進行稀釋， 使其成為 1μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L、10μg/L 的工作液，當要對工作液進行臨時使用時，應將其配制添加到空白基質當中，并且每次測定應抽取10μL的工作液進行測定。

二、測定方法

本次測定通過在測定過程中摻入體積分數(shù)為0.1%的甲酸試劑，來實現(xiàn)對流動相PH值的調節(jié)，從而確保測定過程中的磺胺類藥物組分能夠進行分離，并通過在水相中摻入濃度為0.5mol/L的乙酸銨試劑，實現(xiàn)對各磺胺類藥物組分的保留，并能對各組分峰形進行大幅度改善。依據(jù)所測定磺胺類藥物21種組分的分子結構，測定電離方式設定為ESI+，并將這21種磺氨類藥物的組分分別配制成1ng/mL的甲醇溶液，然后利用串聯(lián)質譜儀來掃描離子峰值，并以此作為基礎對其分別進行母離子二級質譜分析，以此明確質譜中信號最強的兩種碎片離子，將子離子與母離子進行組合，使其成為離子對并進行監(jiān)測，然后通過MRM來對樣品定性及定量進行分析。為了使測定的靈敏度更高，本次測定將MRM程序設定為七個，以此實現(xiàn)對這21種磺胺類藥物組分的出峰時間所產(chǎn)生的信號進行收集。本次實驗所選取的試劑包括乙酸乙酯、二氯甲烷及乙腈，用來對海產(chǎn)品中的磺胺類藥物進行分別提取，并對結果進行了對比。此外，本次試驗對樣品凈化條件進行了選擇，并對C18固相萃取小柱與HLB小柱進行了對比實驗，最終確定由Qasis HLB來實現(xiàn)對樣品的凈化，并采取將磺氨標準溶液添加至空白基質的方式來對線性范圍進行確定。本次試驗將日本對蝦、大菱鲆及三疣梭子蟹這三類海產(chǎn)品作為研究對象，對其回收率、檢出限、線性范圍及精密度進行研究，并在樣品中分別添加了三種磺胺類混合標準溶液，回收率及精密度計算中均重復三次實驗，檢出限以3倍信噪比為準，定量限以10倍信噪比為準。

三、測定結果

通過對七個MRM程序中21種磺胺信號的出峰時間信號進行收集，并利用串聯(lián)質譜儀來進行掃描，掃描譜圖結果如圖3所示。

圖3 21種磺胺類藥物信號出峰時間掃描譜圖

依據(jù)出峰順序來進行排列，從左至右依次為：磺胺、磺胺噻唑、磺胺二甲基異惡唑、磺胺硝苯、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺醋酰、磺胺氯噠嗪、甲氧芐氨嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺二甲異嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺胍、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧嗪噠。

經(jīng)過測定結果表明，在乙酸乙酯、二氯甲烷及乙腈試劑分別對海產(chǎn)品中的21種磺胺類藥物提取中，二氯甲烷的提取率最低，而乙酸乙酯與乙腈試劑的提取效率則相對較高。在利用Qasis HLB對樣品進行凈化時，凈化效果效好，樣品回收率高，且操作要求低，能夠非常容易的進行重復操作。經(jīng)過對線性范圍的確定，并以磺胺混合標準溶液來將其添加到空白基質當中，使其成為標準區(qū)線，經(jīng)過測定結果表明，當線性范圍處于1至1004μg/L時，效果最好。對日本對蝦、大菱鲆及三疣梭子蟹的線性范圍、精密度、檢出限及回收率進行測定時，測定結果表明，當標準溶液添加量至1至5μg/Kg時，日本對蝦及大菱鲆樣品中的21種磺胺藥物平均回收率均在68%至82%，回收率標準偏差范圍在4.1%至11.8%。以10倍信噪比作為定量限測定時，定量限均不超過1.0μg/Kg，以3倍信噪比作為檢出限測定時，檢出限均不超過0.5μg/Kg。這三種海產(chǎn)品的21種磺胺類藥物殘留測定結果如圖4所示。

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四、討論

通過對測定結果進行分析可知，由于磺胺類藥物組分耐熱能力較差，而乙腈試劑的沸點則相對較高，這就使磺胺類藥物濃縮時增加很大難度，而在用乙酸乙脂進行濃縮時，回收率較好，并且SPE凈化以后不會出現(xiàn)干擾問題，因此選擇乙酸乙酯試劑最佳。在對樣品凈化時，由于磺胺類的PH值偏向于弱減性，而僅靠溶液的方式是很難去除掉樣品中的干擾物質的，從理論上來講，固相萃取小柱與HLB小柱都適用于對磺胺類藥物的凈化，不過，比較適用于非極性至中極性的磺胺類藥物凈化，而HLB小柱則本身有親脂親水性，因而不存在抽干問題，碳鏈也不會產(chǎn)生塌陷現(xiàn)象，因此，HLB小柱對樣品的凈化效果更好。從圖3中我可以看出，這種測定方法的靈敏度很高，通過對質譜與色譜的調整，能夠極大程度的提高21種磺胺類藥物組分的響應值。此外，如果對噪音進行降低，并選取等級更高的試劑，液相色譜-串聯(lián)質譜法的檢出限將更加精確，也將更能滿足對海產(chǎn)品磺胺類藥物的殘留檢測要求，而這種超高效的測定方法，有效彌補了國內(nèi)測定種類少，靈敏度不高的缺陷，因此極具應用價值。

結語

本次測定方法將日本對蝦、大菱鲆及三疣梭子蟹這三類海產(chǎn)品作為測定樣本，通過利用乙酸乙酯試劑來對21種磺胺類藥物組分進行提取，并用HLB小柱其進行凈化，以小柱作為色譜柱，通過采用乙酸銨溶液及甲醇試液作為流動相，利用液相色譜-串聯(lián)質譜儀來對這三種海產(chǎn)品中的21項磺胺類藥物組分殘留進行同時檢測，并依據(jù)質譜數(shù)據(jù)及時間的差異性來對其進行定性與定量分析，從而取得良好的檢測效果。該測定方法與氣-質聯(lián)用法、高效液相色譜法、免疫測定法的優(yōu)勢相比較，氣-質聯(lián)用法具備極強的分離能力，但對未知化合物的定性能力不足。而液相色譜-串聯(lián)質譜法則充分結合了氣-質聯(lián)用法的分離優(yōu)勢，并且彌補了對未知化合物定性能力不足的缺陷。高效液相色譜法具備反復使用、易回收及樣品不被破壞等優(yōu)點，但它的缺點也非常明顯，就是柱外效應，分離物質的擴散與滯留現(xiàn)象都會使高效液相色譜法的靈敏度受到影響，而液相色譜-串聯(lián)質譜法則具備易回收、樣品不被破壞的優(yōu)勢，雖然靈敏度會受到流動相試劑等級與噪音的影響，但不會受到分離物質擴散與滯留現(xiàn)象的影響。免疫測定法具備操作簡便、特異性強的優(yōu)勢，但缺點是其應用范圍十分有限。而該測定方法的重現(xiàn)性較好，線性范圍非常寬，因此更適合對海產(chǎn)品磺胺類藥物進行測定。更重要的是，以上三種方法都只能對其中幾種磺胺類藥物殘留進行測定，而液相色譜-串聯(lián)質譜法則能同時對上述21種磺胺類藥物殘留進行同時測定，因此其應用前景十分廣闊。

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