王月丹 林怡婷

（北京大學基礎醫(yī)學院免疫學系 北京 100191）

在英語中，汽車被稱為CAR，在T細胞中也有一種被稱為CAR，這就是大名鼎鼎的嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor）T 細胞， 簡稱為 CAR-T細胞。2017年8月30日，美國藥品及食品管理局（簡稱FDA）批準了諾華公司的CAR-T細胞產品［1］——CTL019，用于治療青少年和兒童急性淋巴細胞白血病，成為世界上首個商品化的CAR-T細胞產品。而CTL019治療每位患者的定價則高達47.5萬美元（約合300萬人民幣），幾乎是頂級名車——法拉利488GTB在美國銷售價格（約25萬美元）的2倍。至少從價格的角度來說，將CAR-T細胞稱為T細胞中的豪華轎車一點也不為過。如此昂貴的細胞究竟是什么？它又是如何工作的？

1 CAR-T細胞的工作原理——CAR的組成與功能

T細胞是人體免疫系統(tǒng)中最為重要的免疫細胞，在細胞免疫及免疫應答調節(jié)中，占有核心地位。一旦失去了全部或者部分T細胞，例如HIV感染引起的艾滋病狀態(tài)時，人體的免疫系統(tǒng)及其功能就會崩潰，無法有效應對各種病原體及腫瘤細胞的攻擊，最終導致患者死亡。T細胞是“胸腺依賴的淋巴細胞”的簡稱，是必須依賴胸腺才能發(fā)育成熟的一種適應性免疫應答細胞。在胸腺中，T細胞的前體細胞需要經過陽性選擇才能發(fā)育成熟并獲得對抗原信號的識別能力。在陽性選擇中，只有能夠與自身MHC（主要組織相容性抗原復合體）分子結合的T細胞才能繼續(xù)發(fā)育和成熟，否則將會發(fā)生凋亡而被淘汰。這個過程的結果，也就使得未來成熟的T細胞識別抗原信號時，只能識別由自身MHC分子提呈的抗原信號，即MHC限制性。MHC限制性的存在，保證了T細胞識別抗原信號的精準性，但也使其對抗原信號的識別，需要高度依賴抗原提呈細胞對抗原信號的高效處理和加工過程。

在正常生理條件下，T細胞通過表面的TCR（T細胞抗原受體）識別由抗原提呈細胞表面MHC提呈的抗原信號和共刺激分子的作用下被激活，從而發(fā)揮免疫應答的功能［2］；但在腫瘤等病理條件下，由于腫瘤組織中的抗原提呈細胞（腫瘤細胞本身也可以作為一種抗原提呈細胞）MHC分子和共刺激分子的表達異常，導致T細胞無法有效識別腫瘤細胞的抗原信號，因此無法正確有效地活化，而對腫瘤細胞產生了免疫耐受，導致腫瘤細胞的免疫逃逸。在這種情況下，腫瘤組織中的T細胞不僅不能有效殺傷和清除腫瘤細胞，反而可能淪為腫瘤細胞等“黑惡勢力”的保護傘，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

CAR-T細胞是一種經過人工改造的基因工程化T細胞。最主要的特征是細胞表面具有由人工構建基因表達的嵌合抗原受體（CAR）。一般來說，CAR由胞外段、跨膜區(qū)和胞內段3個區(qū)域組成。其中，CAR的胞外段是抗原信號的識別區(qū)域，一般由抗體的V區(qū)或者其衍生片段組成，可以直接識別完整的具有空間結構的抗原表位，而不會像只有一個狹窄抗原結合槽的TCR那樣只能識別由MHC結合的抗原肽信號。這使得CAR較TCR具有更加廣闊的抗原表位識別范圍。CAR的跨膜區(qū)與TCR的跨膜區(qū)功能一樣，具有錨定作用，可以將CAR固定在T細胞膜上，使其穩(wěn)定地發(fā)揮信號轉導功能。CAR的胞內段則是具有信號轉導功能區(qū)域，具有多個免疫受體酪氨酸激活基序 （immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM），能將CAR接收到的抗原信號，轉化為活化信號，激活T細胞，使其增殖并分化為效應性的T細胞，發(fā)揮抗腫瘤等免疫應答效應。將編碼上述3個部分的基因組合在一起，然后通過載體轉染T細胞，使其在細胞膜上表達并發(fā)揮識別抗原信號的作用，即可成功完成CAR-T的制備。

CAR的設計和制備是CAR-T細胞制備技術的核心，而將CAR基因轉染入T細胞，并獲得CAR-T細胞則是CAR-T細胞制備的另一個關鍵技術。目前，將CAR基因帶入T細胞常用的技術主要有2類：病毒轉染和無病毒體系轉染。其中，利用逆轉錄病毒和慢病毒作為載體，將CAR基因整合入宿主T細胞基因組，穩(wěn)定地產生CAR-T細胞，是目前最為常用的CAR-T細胞制備方法。該方法的基本原理是：利用逆轉錄病毒（人類免疫缺陷病毒HIV也是其中一種）能將自身的基因組注入細胞并整合到宿主DNA分子中的能力，在體外HEK293細胞中包裝制備攜帶CAR的病毒顆粒，再利用病毒自身的感染能力感染T細胞，并將CAR整合到T細胞基因組中，然后通過活化、擴增和篩選，獲得穩(wěn)定表達CAR的T細胞，即CAR-T細胞。以病毒轉染獲得的CAR-T細胞是臨床應用的主要CAR-T細胞來源，目前通過FDA審批上市及臨床研究的CAR-T細胞都是采用這種方法制備的。而無病毒體系轉染獲得CAR-T細胞則主要是通過電擊的方法（電轉法），改變細胞膜的通透性，使攜帶CAR基因的質粒等載體進入T細胞，并在細胞內表達CAR，從而獲得CAR-T細胞。電轉法由于細胞活率較低及轉染細胞量較小等原因，目前基本只用于臨床前的科研工作中。

2 CAR-T細胞的發(fā)展與應用

2.1 第1代CAR-T細胞 1987年,日本人Kuwana將編碼抗肺炎鏈球菌R36A株的抗體可變 （V）區(qū)和TCR恒定（C）區(qū)的基因同時克隆和裝入到表達載體中，并轉染入EL4細胞（一種小鼠淋巴母細胞瘤細胞，具有某些T細胞的特征，表達CD3和CD28分子，可用于T細胞及其激活過程的研究）。然后，利用帶有目標靶抗原的肺炎鏈球菌R36A株抗原，成功地激活了這個工人構建的細胞［3］。這就是CAR-T細胞的雛形。

經過20多年的發(fā)展，到目前為止，根據(jù)CAR的不同，可以將CAR-T細胞分為無共刺激信號CAR-T細胞（第 1代）、單一共刺激信號CAR-T細胞（第2代）、雙/多共刺激信號CAR-T細胞（第3代）和精準CAR-T細胞（第4代）等4個發(fā)展階段。這4代CAR-T細胞的胞外識別區(qū)都是抗體的V區(qū)或其衍生片段（如單鏈抗體V區(qū)片段，ScFV等等），跨膜區(qū)也并無很大區(qū)別，所以一般以CAR的胞內段結構進行它們的階段劃分。

第1代CAR-T細胞CAR的胞內片段結構比較簡單［3-6］，一般是由TCR的恒定區(qū)片段或者CD3分子ζ鏈胞內段構成。TCR的恒定區(qū)并無ITAM區(qū)，只能通過募集結合CD3分子中的ζ鏈，并利用后者鏈內存在的ITAM區(qū)，激活T細胞。從本質上說，第1代CAR-T細胞是模擬天然TCR/CD3復合體的抗原信號激活T細胞。由于第1代CAR并不能同時提供T細胞活化所必須的共刺激信號，必須依賴T細胞自身與抗原提呈細胞的相互作用而獲得的天然共刺激信號，所以其激活T細胞的效率較低，在臨床免疫治療中未能取得預期的理想效果［7］。

2.2 第2代CAR-T細胞 第2代CAR-T細胞的CAR較第1代復雜，其胞內片段不僅包括了CD3分子ζ鏈的ITAM區(qū)，而且還含有一個來自共刺激分子 CD28或者 CD137（4-1BB）的 ITAM 區(qū)，可以通過CAR接受抗原信號的刺激，同時獲得抗原刺激信號和一個共刺激信號（來自CD28或CD137的信號轉導通路）。這種CAR-T細胞活化的能力遠遠強于第1代CAR-T細胞，在臨床實驗研究中取得了令人振奮的治療效果［8］。一般認為，含有CD28活化信號的CAR-T細胞能展示出更強的激活功能，類似于短跑選手的爆發(fā)力；而含有CD137信號的CAR-T細胞則具有更強的持久活化能力，類似長跑運動員的耐力。但是，由于第2代CART細胞使用的載體是逆轉錄病毒，其可容納和攜帶的外源性基因片段長度有限，難以將2個共刺激信號基因同時裝入，因此人們往往不得不在激活的強度和持久性中進行抉擇。

2.3 第3代CAR-T細胞 第3代CAR-T細胞則是第2代CAR-T細胞的直接升級版，利用慢病毒作為載體，具有更大的外源性基因片段的容量，因此可以在包含了CD3分子ζ鏈的ITAM區(qū)后，仍然可以同時容納2個或者2個以上的共刺激分子基因片段或者其他免疫分子片段（例如IL-12、IL-15和GM-CSF等細胞因子的基因）［9］。其中，有人也把具有2個共刺激分子基因和同時帶有持續(xù)或可誘導表達的IL-12、IL-15或GM-CSF細胞因子基因的CAR-T細胞稱為4代CAR-T細胞。但是，這種CAR-T細胞在原理上與第3代CAR-T細胞基本一致，只是載體容量更大，只能算是一種3代+或者3.5代的CAR-T細胞。與前2代CAR-T細胞，第3代CAR-T細胞展現(xiàn)出非常強大的免疫應答能力，可以迅速大量地清除患者體內的腫瘤細胞。但是，由于CAR中缺乏可控元件或者精準識別機制的設計，第3代CAR-T細胞治療經常會引起炎癥因子釋放綜合征等嚴重的不良反應，并存在導致腫瘤抗原脫靶而損傷正常細胞的潛在風險。

2.4 第4代CAR-T細胞 第4代CAR-T細胞也被稱為精準CAR-T細胞。這一代的CAR-T細胞設計主要是從腫瘤等疾病的精準治療角度考慮的。目前，CAR可以識別的腫瘤抗原均為CD19等腫瘤相關抗原，在腫瘤細胞表面表達但在某些正常細胞表面也可能有低水平的表達，這可能導致CAR-T細胞治療的脫靶（損傷了正常細胞）問題。CAR-T細胞一般具有很長的壽命，可在患者體內生存5年以上，如此長的生存期雖然有利于CAR-T細胞徹底清除和控制腫瘤細胞，但另一方面也可能會在完全清除腫瘤細胞以后，對正常細胞產生傷害。為解決此問題，人們一方面構建了帶有自殺基因或者可控性自殺基因（例如某些藥物敏感基因）的CAR-T細胞，使CAR-T細胞在體內的行為能夠自限或者可控，避免在清除腫瘤細胞后傷害正常組織細胞；另一方面，人們發(fā)明了雙信號通路CAR-T細胞，分別將控制T細胞活化的2條不同信號通路的CAR（通常一條通過TCR/共刺激信號通路，另一條通過NOTCH信號通路）同時轉染入T細胞，2條通路識別的腫瘤抗原是不同的。腫瘤細胞往往同時表達這2種抗原，而正常組織細胞只表達其中一種，當雙信號通路CAR-T細胞遇到腫瘤細胞時，2個通路同時活化，而被激活，殺傷腫瘤細胞，而遇到正常細胞時，只有一個通路活化，不會殺傷正常的組織細胞，實現(xiàn)了CAR-T細胞識別的精準化［10］。然而，目前第4代的CAR-T細胞還多是一種停留在實驗室科研階段的概念性CAR-T細胞，在臨床還未被廣泛應用。

目前，CAR-T細胞已經被廣泛應用于各種腫瘤的細胞免疫治療中［11-13］。據(jù)統(tǒng)計，包括美國FDA在內的多個國家藥監(jiān)部門已經批準了多達300個以上的CAR-T細胞治療臨床實驗的項目。來自這些臨床實驗治療項目的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，雖然由于使用了不同的CAR和T細胞來源與制備工藝，以及預處理和聯(lián)合用藥的差異，導致各個臨床項目的效果存在一定差異，但總體顯示，CAR-T細胞治療腫瘤是有效的，其有效率為30%～70%，甚至可以高達90%以上。例如，F(xiàn)DA已經批準上市的諾華CTL019治療非何杰金淋巴瘤的完全緩解率竟然達到了令人驚訝的93%。也許，CAR-T細胞治療將徹底終結人類因腫瘤喪生的宿命。

3 CAR-T細胞治療存在的問題及其對策

雖然，在多年的臨床試驗中，CAR-T細胞展現(xiàn)出了令人驚嘆的理想效果，但在應用中，人們也發(fā)現(xiàn)了嚴重不良反應的發(fā)生、實體瘤應用困難、T細胞來源、載體問題及治療的脫靶和耐藥等一系列問題，影響和限制了其進一步的應用和推廣。

從目前的臨床實驗數(shù)據(jù)看，CAR-T細胞治療相關的細胞因子釋放綜合癥（CRS）和神經系統(tǒng)不良反應，是CAR-T細胞治療最為常見的嚴重不良反應。這2種不良反應極大降低了患者對治療的耐受性，甚至可能危及患者的生命安全，因此必須認真處理和面對。其中，CRS的發(fā)生主要是由于患者體內存在的大量腫瘤細胞，在短時間內被CAR-T細胞大量殺傷，在局部和全身產生了大量的炎癥激活物，使巨噬細胞和T、B淋巴細胞等免疫細胞大量釋放炎癥性的細胞因子，引起免疫系統(tǒng)過度活化，導致患者出現(xiàn)高熱、低血壓休克等一系列的全身炎癥反應性癥狀。一般來說，CRS是可控和可防的。臨床應用抗IL-6的單克隆抗體，可以極大減少甚至避免CRS的發(fā)生，并減輕其嚴重程度。在CRS過后，接受CAR-T細胞治療的患者，往往還要面臨該療法的神經系統(tǒng)并發(fā)癥的威脅。當發(fā)生此并發(fā)癥時，患者腦部可發(fā)生水腫，并出現(xiàn)震顫、頭痛、失語、幻覺、意識混亂、平衡失調和癲癇發(fā)作等神經系統(tǒng)癥狀，甚至導致患者的死亡。發(fā)生神經毒性的原因，目前尚不清楚，但有人推測是與患者腦部存在的腫瘤細胞，吸引了CAR-T細胞在腦部大量殺傷而釋放炎性物質有關，因此建議糖皮質激素治療可能有效。此外，CAR-T細胞還有可能引起惡心、乏力、肌肉酸痛、低氧血癥、低血壓和腎功能衰竭等其他不良反應。一般來說，對這些癥狀對癥處理，即可緩解。當然，隨著抗IL-6抗體和轉移因子等T細胞功能輔助藥物的應用和推廣，CAR-T細胞的治療效果和治療相關的不良反應，都會得到進一步改善。

到目前為止，CAR-T細胞在實體瘤治療中取得的效果遠不如其在白血病等造血細胞來源的惡性腫瘤中的效果。這主要是由于實體瘤一般存在著阻礙CAR-T細胞進入的各種生物屏障，導致CAR-T細胞無法大量聚集在腫瘤組織的深處，從而影響CAR-T細胞的免疫治療效果。為解決此問題，人們一方面通過生物學技術，將編碼腫瘤組織靶向的趨化因子受體和黏附因子的基因組合到CAR中，使CAR-T細胞能夠趨化、遷移和進入實體瘤中，發(fā)揮抗腫瘤效應；另一方面，則采取物理方法，利用微導管，結合影像學定位，將CAR-T細胞直接注入腫瘤組織的內部，從而直接在實體瘤局部發(fā)揮免疫治療的作用。

早期的CAR-T細胞都是由來自腫瘤患者自身的T細胞制備，但是，由于化療及病情進展等原因，獲得足量的患者自身健康T細胞并不容易，而且由于制備CAR-T細胞耗時較多，患者的病情往往等不及應用。因此，制備和儲存來源于健康志愿者的異體CAR-T細胞，制成像藥物一樣隨時可用（onshelf）的產品，是CAR-T細胞研發(fā)的一大熱點。目前，人們已經可以通過crispr/cas9技術對異體T細胞原有的TCR基因進行編輯和刪除，從而避免異體T細胞輸注引起的移植物抗宿主?。℅VHD），使異體CAR-T細胞療法日趨接近成熟。

基因轉染技術的發(fā)展是推動和制約CAR-T細胞技術發(fā)展和應用的重要因素。增加載體的基因片段容量和轉染表達效率，既是相互制約的矛盾（因為外源基因片段越大，轉染表達效率越低），也是載體發(fā)展必須前進的方向。同時，CAR-T細胞的常用病毒載體均來自HIV的近親逆轉錄病毒和慢病毒，雖然現(xiàn)有的技術已經能夠切除野生病毒原有的致病基因，但隨著接受CAR-T細胞治療患者生存期的延長，其潛在的風險，依然引起很多人的關注和警惕。因此，發(fā)展電轉等無病毒體系制備CAR-T細胞的技術與設備，也是臨床大規(guī)模應用CAR-T細胞治療的一個發(fā)展方向。

當然，CAR-T細胞療法的應用和推廣，離不開對靶標抗原的開發(fā)與精準識別。與其他的腫瘤治療方法一樣，CAR-T細胞治療也存在著耐藥的問題。據(jù)報道，利用識別CD19的CAR-T細胞治療1年后，大約2/3的患者會出現(xiàn)腫瘤細胞CD19分子表達的缺失而耐藥復發(fā)。對這類耐藥現(xiàn)象，必須應用靶向其他腫瘤抗原分子（例如CD20等）的CAR-T細胞或者CD19/CD20的雙特異性CAR-T細胞等。因此，CAR-T細胞的應用必須建立在足夠大的腫瘤抗原庫研究的基礎上。而解決CAR-T細胞治療脫靶的問題，減少其對正常組織細胞的損傷（例如CD19靶向 CAR-T細胞引起的 B 細胞缺乏［14］），也必須建立在腫瘤抗原表達精細化研究的基礎上。

此外，CAR-T細胞只能識別腫瘤細胞表面表達的抗原，而無法識別其細胞內部表達的腫瘤抗原（例如MAGE-A等癌睪丸抗原）信號，此時就需要聯(lián)合應用轉TCR-T細胞——另一種可識別胞內抗原信號的基因工程化T細胞，從而通過基因工程化T細胞免疫治療的“雙劍合璧”，徹底清除腫瘤細胞。

4 CAR-T細胞的未來與展望

CAR-T細胞是本世紀初免疫治療領域最為重要的進展之一［15］，也將可能成為21世紀人類最終戰(zhàn)勝腫瘤等致命疾病最為重要的免疫學技術。CAR-T細胞如同T細胞一樣，直徑只有6～18 μm，從尺度上看，稱其為一種微米“機器人”細胞是十分恰當?shù)?。通過不斷地研制和開發(fā)CAR，提高其精準度和有效性，該細胞機器人完全可以成為能夠精準清除體內致命細胞克隆的顯微“手術刀”，不僅能用于治療惡性腫瘤、自身免疫病和GVHD等免疫相關疾病，還可以用于治療基因缺陷或者病毒感染細胞導致的遺傳及感染性疾病，為人類戰(zhàn)勝疾病和延長壽命，提供更加有效的健康保障。