馬玉娥

（蘇州大學(xué)劍橋-蘇大基因資源中心，江蘇蘇州215123）

在當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)研究中，嵌合體制備技術(shù)發(fā)揮著非常重要的作用，已被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、胚胎學(xué)、毒理學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等眾多研究領(lǐng)域[1-3]。將經(jīng)基因修飾的胚胎干（ES）細(xì)胞導(dǎo)入小鼠植入前胚胎制備的生殖系傳遞的嵌合個(gè)體，已成為基因功能和致病機(jī)理等方面研究的重要模式。所謂嵌合體是指由兩種或兩種以上具有全能性和多能性的細(xì)胞系發(fā)育而成的復(fù)合體。目前，制備嵌合體主要有顯微注射法、聚集法和共培養(yǎng)法三種。

顯微注射法是通過(guò)使用顯微操作儀將ES細(xì)胞注入胚胎中制備嵌合體。聚集法是較受歡迎的制備嵌合體的方法，僅次于顯微注射法，它是將去除透明帶的4-細(xì)胞期或8-細(xì)胞期胚胎或桑葚胚與ES細(xì)胞置于聚集培養(yǎng)液中進(jìn)行聚集，該方法不需要昂貴精密的儀器，操作簡(jiǎn)單、效率高，但成功率低。由于需要較多的胚胎進(jìn)行操作，而近交系小鼠因其產(chǎn)卵量少不適合此方法。另外，因其無(wú)法對(duì)ES細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量篩選，導(dǎo)致在體外培養(yǎng)和操作時(shí)間長(zhǎng)，易受理化因素的影響。共培養(yǎng)法是將ES細(xì)胞同去除透明帶8-細(xì)胞時(shí)期胚胎培養(yǎng)，該方法可同時(shí)對(duì)大量胚胎進(jìn)行操作，技術(shù)簡(jiǎn)單，不需要貴重的儀器，但成功率低，當(dāng)前研究中很少使用該方法。本文結(jié)合最常用的方法—顯微注射法及其制備嵌合體影響因素的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 顯微注射法

顯微注射法制備嵌合體最早由Gardner于1968年創(chuàng)建，其通過(guò)囊胚腔注射法成功獲得嵌合體[4]。1984年Bradley等[5]首次成功獲得生殖系傳遞的嵌合小鼠，使用的也是囊胚腔注射法，此后該方法才逐漸發(fā)展成熟，并得以廣泛應(yīng)用。所謂顯微注射法是指通過(guò)顯微注射儀將挑選好的一定數(shù)目的ES細(xì)胞注入胚胎中，一般采用囊胚注射，也有實(shí)驗(yàn)室采用8-細(xì)胞注射，即選用的是不同發(fā)育階段的胚胎。但囊胚注射被認(rèn)為是獲得嵌合體的最常用和最經(jīng)典的方法。其優(yōu)點(diǎn)是可在顯微鏡下挑選光滑、圓形的形態(tài)質(zhì)量好的細(xì)胞，受到體外各種因素的影響也會(huì)因胚胎和干細(xì)胞在體外暴露的時(shí)間短而明顯減少。另外，該方法穩(wěn)定、重復(fù)性強(qiáng)、成功率高，但也存在一定的缺點(diǎn)：需要昂貴的儀器設(shè)備和熟練的操作技能，效率低，平均每小時(shí)只能注射20～40枚囊胚，一天注射的胚胎數(shù)量極限為100個(gè)。8-細(xì)胞注射主要是將ES細(xì)胞注入8細(xì)胞期胚胎的卵裂球間隙。該方法可以獲得較多的嵌合鼠，這是由于8細(xì)胞晚期胚胎的分裂球開(kāi)始致密化，分裂球間建立了各種連接，此時(shí)引入ES細(xì)胞，很容易與宿主細(xì)胞之間建立聯(lián)系。但該方法中注射針易傷及卵裂球，造成胚胎的損傷，不利于嵌合胚的生長(zhǎng)發(fā)育。近年來(lái)，壓電微操作系統(tǒng)（Piezo）的應(yīng)用，成功地解決了注射針損傷胚胎的難題，極大地提高了注射成功率和注射效率。有研究表明，與傳統(tǒng)的注射方法相比，通過(guò)應(yīng)用Piezo設(shè)備，可以提高嵌合體小鼠的出生率和雄性嵌合鼠數(shù)目，而且對(duì)胚胎無(wú)傷害[6]。但該方法因需要額外投入昂貴的儀器以及對(duì)操作技能的更高要求而未得到廣泛的應(yīng)用。目前，使用傳統(tǒng)的顯微注射法將來(lái)源于C57BL/6品系的ES細(xì)胞注入遠(yuǎn)交或近交白化鼠囊胚已成為一種標(biāo)準(zhǔn)的注射方法。

2 嵌合體制備影響因素

顯微注射法制備嵌合體小鼠除受操作技巧熟練程度的影響，還受ES細(xì)胞的影響，包括ES細(xì)胞特性、質(zhì)量、背景及注射時(shí)挑選的ES細(xì)胞數(shù)目。

2.1 ES細(xì)胞的特性

1981年，Evans等[7]首次報(bào)道了從正常小鼠胚胎中分離建立了胚胎多能干細(xì)胞系，簡(jiǎn)稱ES細(xì)胞。該細(xì)胞具有在體外無(wú)限增殖能力和多方向分化潛能以及種系嵌合能力的特性，而ES細(xì)胞的全能性保持是制備嵌合體的先決條件。維持ES細(xì)胞增殖同時(shí)抑制其分化傾向，其分化全能性才得以保持，否則意味著嵌合體制備的失敗。

ES細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)條件要求非常嚴(yán)格，不僅需要優(yōu)質(zhì)的培養(yǎng)液來(lái)提供必需的營(yíng)養(yǎng)成分和能源物質(zhì)，還需要足夠的分化抑制因子，如白血病抑制因子（LIF），維持其未分化狀態(tài)[1]。研究表明，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）上清液培養(yǎng)體系不僅能長(zhǎng)期有效維持小鼠胚胎干細(xì)胞的增殖，并且能夠有效地抑制其分化[8]。Ramire等[9]發(fā)現(xiàn)注射前2h更換新鮮ES細(xì)胞培養(yǎng)液可提高制備嵌合鼠的效率，這是由于通過(guò)該操作，細(xì)胞的活性得到增加。

2.2 ES細(xì)胞的數(shù)目和質(zhì)量

前期研究數(shù)據(jù)表明，引入早期胚胎的ES細(xì)胞數(shù)目會(huì)影響嵌合體的制備。細(xì)胞數(shù)目過(guò)少會(huì)使獲得的嵌合體的嵌合率很低；過(guò)多則會(huì)使早期胚胎生長(zhǎng)發(fā)育異常，易在孕中期被吸收。要保證出生的小鼠有較高的嵌合率和正常發(fā)育率，Robert等[10]發(fā)現(xiàn)注射的ES細(xì)胞數(shù)目一般為5～10個(gè)或10～15個(gè)。有研究表明注入多個(gè)ES細(xì)胞可提高其與宿主囊胚細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)力，推測(cè)其原因：一是多個(gè)ES細(xì)胞相互間可通過(guò)分泌未知因子來(lái)維持其存活和發(fā)育能力，二是多個(gè)細(xì)胞增加了整合到ICM的概率[11]。通常情況下，為得到較高的嵌合效率，注入囊胚的ES細(xì)胞數(shù)目控制在10～15個(gè)。

除引入早期胚胎的ES細(xì)胞數(shù)目外，其質(zhì)量也會(huì)影響嵌合體制備成功率。ES細(xì)胞的質(zhì)量受培養(yǎng)環(huán)境和傳代次數(shù)影響。培養(yǎng)環(huán)境不良會(huì)使ES細(xì)胞核型不穩(wěn)定，易發(fā)生基因外改變等異?，F(xiàn)象。異常的ES細(xì)胞無(wú)法通過(guò)形態(tài)被確認(rèn)，且不具備正常的發(fā)育能力，導(dǎo)入后會(huì)使ES細(xì)胞數(shù)目難以與嵌合體發(fā)育形成準(zhǔn)確的對(duì)應(yīng)關(guān)系[2]。另外，ES細(xì)胞的傳代次數(shù)越高，核型越不穩(wěn)定，易發(fā)生遺傳性變異，從而導(dǎo)致小鼠遺傳背景的不穩(wěn)定，降低了嵌合體小鼠制備的成功率。因此，在實(shí)驗(yàn)中一般選擇傳代次數(shù)低的細(xì)胞[3]。但傳代次數(shù)過(guò)低會(huì)易導(dǎo)致雜細(xì)胞較多，增加挑選細(xì)胞的難度，降低注射效率。

2.3 ES細(xì)胞和宿主囊胚的遺傳背景

在嵌合體鼠的制作過(guò)程，供體和受體鼠的遺傳背景不匹配同樣會(huì)影響嵌合體制備的成功率。目前，有關(guān)供體鼠和受體鼠組合的研究報(bào)道很多，通?？蓪?duì)出生后的嵌合個(gè)體進(jìn)行初步判斷，依據(jù)是細(xì)胞來(lái)源小鼠品系和供體鼠之間存在的毛色差異。129品系ES細(xì)胞由于穩(wěn)定和易于種系嵌合等因素常被用來(lái)做基因修飾性小鼠模型，但129背景的鼠繁殖力差，免疫和行為方面容易異常，并且在獲得打靶動(dòng)物后還需要回交到C57BL/6品系，比較耗時(shí)耗力[12-13]。而C57BL/6品系卻不存在這些不足，且不需要回交到C57BL/6，不僅節(jié)省了時(shí)間，還避免因背景不純引起的不穩(wěn)定結(jié)果。另外，該品系已經(jīng)用來(lái)進(jìn)行小鼠全基因測(cè)序，遺傳背景信息豐富且清楚。因此，目前C57BL/6背景的ES細(xì)胞被認(rèn)為是用于同源重組的最佳選擇。

隨著國(guó)際敲出小鼠聯(lián)盟（IKMC）使用C57BL/6N品系的ES細(xì)胞制作嵌合鼠的影響力不斷擴(kuò)大，目前越來(lái)越多的研究致力于利用C57BL/6N品系的ES細(xì)胞和不同品系的受體鼠胚組合來(lái)提高生殖嵌合力。Thomas等[14]選用C57BL/6N和C57BL/6J的小鼠品系作為供體胚，注入C57BL/6N來(lái)源的ES細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)C57BL/6J鼠胚的生殖嵌合率顯著高于C57BL/6N。Tuija等[15]通過(guò)分別向BALB/c和Tyr鼠胚中注入C57BL/6N ES細(xì)胞并進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)雖然Tyr鼠在囊胚獲取量上存在優(yōu)勢(shì)，但BALB/c鼠在小鼠出生率、嵌合率、雄性嵌合率、生殖嵌合率方面均高于Tyr鼠，表明BALB/c鼠胚較適合C57BL/6N ES細(xì)胞注射。

此外，需要注意的是，顯微注射過(guò)程中，要挑選小的，光滑的，圓形的ES細(xì)胞。細(xì)胞不能過(guò)小，否則會(huì)吸入較多的培養(yǎng)液，注射到囊胚腔后會(huì)稀釋其中的重要因子；過(guò)大會(huì)被擠壓，導(dǎo)致變形，影響細(xì)胞質(zhì)量，通常以注射針的直徑大小為宜。注射針中吸取的ES細(xì)胞數(shù)目不要太多，否則細(xì)胞易擠壓變形，易發(fā)生黏針、堵針，增加操作的難度，而且細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)目會(huì)受到影響。另外，移植體品系的選擇，移植等技術(shù)環(huán)節(jié)都會(huì)影響嵌合體的成功制備。

3 結(jié)語(yǔ)

嵌合體制備技術(shù)不僅在生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著巨大的作用，如研究基因功能、探究人類疾病機(jī)理、研究細(xì)胞分化機(jī)制等，而且在畜牧生產(chǎn)上有著廣泛的應(yīng)用前景：培育動(dòng)物新品種（高產(chǎn)，優(yōu)質(zhì)，抗病等），而利用四倍體胚胎補(bǔ)償技術(shù)（即以四倍體囊胚為宿主獲得的嵌合體）和其他技術(shù)結(jié)合可以達(dá)到優(yōu)良性狀或?yàn)l危動(dòng)物遺傳資源保種目的。但如何高效獲取嵌合體的問(wèn)題仍需要去研究和解決，本文闡述了嵌合體制備的最常用方法-顯微注射法以及嵌合體制備的影響因素，對(duì)高效獲取嵌合體具有一定的指導(dǎo)意義。