高璇

（山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東濟南250000）

細胞色素P450廣泛地分布在動物、植物和微生物中。P450在高等植物的微粒體、液泡膜、線粒體膜等中大量存在，其中在微粒體中的含量最高。植物的各器官中，葉片中含有的細胞色素P450最高，其次是花朵、莖中。植物細胞色素P450對植物本身有著非常多作用，有助于植物新陳代謝，合成或分解激素，還能抵御生物以及非生物脅迫，用于合成花粉孢粉素等。

1 細胞色素P450的發(fā)現(xiàn)

1969年，D.S.Frear等人首次在棉花中發(fā)現(xiàn)了細胞色素P450，隨后在更多的植物中發(fā)現(xiàn)了P450，如小麥、水稻中[1]。根據(jù)現(xiàn)階段的研究成果，P450的基因數(shù)目占據(jù)了物種總基因數(shù)目的1%，說明了細胞色素P450基因的多樣化。小麥作為我國主要的糧食作物之一，在生長過程中，P450基因發(fā)揮著重要的作用，能提升小麥的抗逆性，豐富其抗性基因資源。參照以往的小麥細胞色素P450研究成功，發(fā)現(xiàn)小麥P450能解毒和促進代謝和氧化等。Cabello-Hurtado等人從小麥中提取了編碼鈍葉醇的CYP51基因，酵母中表達該基因，能增強羊毛甾去甲基化的活性[2]。Forthoffer等人研究認為，有3個及以上的P450參與了除草機解毒過程，除草劑的毒性能提升P450的活性[3]。小麥中的一個P450基因和赤霉病的抗性也有著密切的聯(lián)系，這個P450基因在抗性品種中的表達量非常高，說明P450基因?qū)τ谛←溄舛竞头烙鹬e極的效應(yīng)。

2 試驗材料和方式

2.1 試驗材料

本次研究材料選擇某小麥品種，使用Trizol試劑盒，RACE試劑盒(美國Invitrogen公司），從Fermentas公司購入反轉(zhuǎn)錄試劑，另外試驗用到的Ex Taq酶、pMD18-T載體從Transgen公司購入。

2.2 試驗方法

2.2.1 提取小麥基因組DNA和總RNA

使用Trizol方法提取小麥葉片中的RNA，使用CTAB方法提取基因組中的DNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得出完整的cDNA鏈，并將其在-20℃的環(huán)境下保存。

2.2.2 克隆TaP450基因

使用已知的小麥P450基因序列在數(shù)據(jù)庫中搜索，將得出的序列進行拼接比對，獲取到68個Contig，選出和已知小麥P450基因差異較大的序列研究。研究中將該拼接序列作為模板，并設(shè)計引物TaP450-S和TaP450-A，其中TaP450-S的序列為5'-CCTCTTCCTGCTCCACTACA-3'；TaP450-A 引 物的 序 列 為5'-GCCTTATTACGCCAACAACGC-3'[4]。用小麥葉片cDNA作為模板進行PCR的擴增。在94℃下預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，75℃延伸10min，對目的條帶連接pMD18-T載體進行測序，依照測試結(jié)果設(shè)計5'-RACE引物和3'-RACE引物，進行RACE擴增，連入pMD18-T進行載體測序，拼接獲得TaP450基因的全長cDNA序列。

2.2.3 TaP450基因生物信息學(xué)分析和基因組序列克隆

使用ExPASy軟件，對TaP450基因編碼蛋白的分子量等進行分析。在對Ta基因組序列進行克隆時，以小麥葉片中基因組DNA作為模板，使用引物TaP450-gS（序列：5'-AGAAGAGATGAACCACGAA-3'）以及TaP450-gA（序列：5'-GCCTTATTACGCCAACAAGC-3'）進行PCR的擴增，反應(yīng)程序是94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，53℃時退火30s，72℃時延伸5min，30個循環(huán)，72℃時延伸10min。將擴增片段連入到pMD18-T載體進行測序，從而獲得TaP450的基因組序列[5]。

2.2.4 TaP450組織特異性表達和脅迫處理表達

將小麥葉子、莖部、根部以及種子的總RNA提取，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用小麥Actin基因為內(nèi)參，檢測TaP450在小麥不同部位的相對表達量。對TaP450進行脅迫處理時，選用狀態(tài)一致小麥，使用200mmol/L的NaCl浸泡24h，20%的PEG6000浸泡24h，用100μmol/L的ABA葉面噴施，恢復(fù)生長24h。損傷葉子恢復(fù)生長24h。提取葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，檢測TaP450在多種脅迫下的相對表達量[6]。

2.2.5 半定量RT-PCR檢測

用小麥的Actin作為內(nèi)參，使用TaActin-S（序列：5'-AGCCATACCGTGCCAATC-3'）和引物TaActin-A（序列：5'-AGAGCCTCCAATCCAGAC-3'），反應(yīng)程序是94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，經(jīng)過28個循環(huán)后在72℃下延伸10min，根據(jù)TaP450基因設(shè)計引物TaP450-RTS（序列：5'-ATGTCAGAGGAGGCCCAGGAGTTCA-3'）和引物TaP450-RTA（序列：5'-ATGTCAGAGGAGGC CCAGGAGTTCA-3'），實施組織器官表達和脅迫處理表達，反應(yīng)程序在94℃下預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，經(jīng)過28個循環(huán)后72 ℃延伸 10min。

3 結(jié)果與分析

3.1 TaP450基因克隆和序列分析

PCR擴增后得到長為1546bp的目的條段，這片段序列和拼接序列大致相同，存在3個堿基差異。對5'-RACE和3'-RACE擴增后將三條序列拼接，得到長為2033bp的DNA片段，這個片段有長度為1557bp的開放讀碼框，有polyA尾[7]。

3.2 TaP450編碼蛋白生物信息

TaP450基因編碼蛋白中的氨基酸數(shù)量有518個，分子量是57.092kD，等電點是8.63。TaP450蛋白N端有長度29的氨基酸跨膜結(jié)構(gòu)和長度22的氨基酸信號鈦。通過分析得出該蛋白是分泌蛋白，和已知的P450蛋白比對，該蛋白和已知的P450蛋白的氨基酸序列不同，存在著很大差異，序列相似性低。

3.3 TaP450基因組序列克隆分析

用小麥基因組DNA作為模板，進行PCR擴增，得到長度為2643bp的DNA片段。經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)基因組序列中有長度為1086 bp的內(nèi)含子，兩個外顯子的長度分別為942bp和615bp。

3.4 TaP450基因特異性表達和脅迫表達

經(jīng)過分析后發(fā)現(xiàn)，TaP450基因在小麥中的多個部位都有表達，其中在小麥的葉片中的表達量最高，在小麥的根部的表達量較低。脅迫表達分析方面，設(shè)置了不同的脅迫條件，對不同環(huán)境下TaP450表達量變化作出了檢測。通過對檢測結(jié)果的研究，發(fā)現(xiàn)TaP450在受到鹽、機械損傷后，表達量出現(xiàn)明顯的上調(diào)。經(jīng)過PEG6000以及冷處理時，表達量的變化不明顯[8]。對比得出結(jié)論，說明TaP450基因?qū)}、機械損傷等比較的敏感，對冷處理等不敏感。不同脅迫處理后，發(fā)現(xiàn)TaP450基因?qū)}脅迫最為敏感，得出TaP450基因和鹽脅迫的關(guān)系密切。

4 結(jié)語

P450作為一種氧化酶，有著強大的功能，能促進小麥的新陳代謝，并有著解毒的功效。本次研究中從小麥中提取了一個新的P450基因——TaP450，這個新的TaP450基因和已知的P450基因存在著較大的差異性，并且TaP450基因在小麥的各個部位都有表達，其中在小麥的葉片和頸部的含量最高，在種子以及根部的表達量較低。受到多種環(huán)境脅迫時，發(fā)現(xiàn)TaP450基因?qū)C械損傷在鹽脅迫下的表達量上調(diào)較為明顯，其中以在鹽脅迫下的表達最為顯著，說明了TaP450基因和逆境脅迫相關(guān)。研究中，TaP450基因在水楊酸處理下上調(diào)，表明了該基因在一定程度上能增強小麥的抗病性。通過對小麥的蛋白序列進行分析，發(fā)現(xiàn)TaP450蛋白N端的信號鈦，證明了屬于分泌蛋白。對TaP450基因的克隆和表達分析，發(fā)現(xiàn)了新的P450成員，為增強小麥的抗逆性提供了幫助。