陳小強(qiáng)， 李 弈， 王景太， 朱立媛， 肖麗君， 孫 寧， 王東元， 覃美運(yùn)

(天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384)

四棱石斛(Dendrobiumtetragonum)屬蘭科石斛屬，具有重要觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值[1]。近幾年來(lái)，隨著藥用石斛開發(fā)利用的不斷深入和國(guó)內(nèi)外需求量的逐年增加，我國(guó)野生四棱石斛資源遭到了嚴(yán)重破壞。在自然條件下四棱石斛能傳粉結(jié)果，但結(jié)果率很低；能進(jìn)行種子繁殖和營(yíng)養(yǎng)繁殖，但繁殖速率低下，自然更新能力差。人工授粉可以大大提高多數(shù)石斛的結(jié)果率，但操作上費(fèi)時(shí)費(fèi)力；而植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)大批量地培育出所需要的植物新個(gè)體，還可以防止植物病毒的危害，極大地提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率，對(duì)于四棱石斛野生資源的保護(hù)和擴(kuò)大栽培及其綜合利用具有極其重要的意義。

四棱石斛是傳統(tǒng)名貴中藥材且為上品，經(jīng)過國(guó)內(nèi)外學(xué)者幾十年來(lái)對(duì)石斛的藥理研究，發(fā)現(xiàn)石斛中主要的藥用成分是生物堿和多糖[2]。其中，多糖屬于活性多糖的一種，是石斛的主要次生代謝產(chǎn)物，具有降血糖、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種功能[3]。

顧慧芬等的研究表明，鐵皮石斛組培苗和野生品多糖類型和含量基本相同[4]。高建平等研究報(bào)道，鐵皮石斛組織培養(yǎng)物原球莖具有促進(jìn)模型鼠體內(nèi)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用且其作用與原藥材相似[5]。這些研究都表明，以組織培養(yǎng)物代替原植物作藥用是可行的。

水楊酸(salicylic acid，簡(jiǎn)稱SA)是一種重要的能夠激活植物過敏反應(yīng)和系統(tǒng)獲得性抗性的內(nèi)源信號(hào)分子，能夠促進(jìn)與植物防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)的次級(jí)代謝產(chǎn)物的高水平合成[6]。有試驗(yàn)表明，水楊酸對(duì)離子吸收、膜的通透性以及一些重要代謝過程起調(diào)控作用，可以促進(jìn)玉米胞內(nèi)可溶性糖向多糖轉(zhuǎn)化，增加胞內(nèi)多糖的含量[7]。王博等的試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著水楊酸濃度的增加，霍山石斛類原球莖生長(zhǎng)受到一定程度的抑制，多糖的合成也表現(xiàn)出先增加后降低的現(xiàn)象，說明水楊酸促進(jìn)多糖的合成有一個(gè)適合的作用濃度[8]。

本研究以四棱石斛試管苗為材料，通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究不同濃度水楊酸在一定的激素[6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)]濃度水平調(diào)節(jié)下對(duì)四棱石斛類試管苗生長(zhǎng)、多糖合成的影響，旨在獲得適合四棱石斛生長(zhǎng)且促進(jìn)多糖合成的水楊酸與激素濃度的最佳配比方案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

四棱石斛試管苗，由天津農(nóng)學(xué)院植物細(xì)胞工程研究中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同種類及濃度的植物激素對(duì)四棱石斛試管苗生長(zhǎng)的影響 利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)四棱石斛試管苗進(jìn)行擴(kuò)繁，利用雙因素法選擇初步培養(yǎng)試管苗的培養(yǎng)基配方為MS+6-BA+NAA+6.5 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+2 g/L活性炭。將6-BA和NAA的濃度分別設(shè)為3個(gè)梯度，另設(shè)1組空白對(duì)照(均不添加6-BA、NAA)，共10組，每組5次重復(fù)，選擇最適合四棱石斛試管苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，四棱石斛試管苗增殖培養(yǎng)的激素配比見表1。

表1 四棱石斛試管苗增殖培養(yǎng)的激素配比

1.2.2 不同濃度水楊酸對(duì)四棱石斛試管苗生長(zhǎng)的影響 選擇最適合四棱石斛試管苗生長(zhǎng)的激素組合后，在此基礎(chǔ)上采用單因素法向培養(yǎng)基中加入3個(gè)濃度梯度的水楊酸(10、20、30 μmol/L)進(jìn)行調(diào)節(jié)，另設(shè)1組空白對(duì)照(1.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA)，共4組配比，依次編號(hào)為1、2、3、4，每組5次重復(fù)。根據(jù)四棱石斛試管苗生長(zhǎng)的不同階段所測(cè)的多糖含量篩選出促進(jìn)多糖生成的培養(yǎng)基配方。

1.2.3 四棱石斛試管苗多糖的提取及測(cè)定 多糖的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[9]。根據(jù)李滿飛等的方法[10]進(jìn)行改良，四棱石斛多糖的測(cè)定方案如下：精確稱取四棱石斛樣品2 g，研磨，放入燒杯中，量取20 mL蒸餾水加入其中，煮1 h，在離心機(jī)中于3 000 r/min離心5 min，收集上清液待用；將濾渣放入燒杯，再加入20 mL蒸餾水，進(jìn)行二級(jí)提取1 h，之后離心收集上清液，并測(cè)量2次提取液的體積；吸取0.1 mL提取液于試管中，分別稀釋10、20、30倍，取1 mL稀釋液，加入1 mL 5%苯酚，搖勻，再精確加入5 mL濃硫酸，邊搖邊加入，冷卻至室溫?？瞻讓?duì)照組為1 mL蒸餾水+1 mL苯酚+5 mL濃硫酸，用754型分光光度計(jì)在490 nm處測(cè)定其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素濃度配比下四棱石斛試管苗生長(zhǎng)狀況的研究

在不同激素調(diào)節(jié)下，四棱石斛生長(zhǎng)狀況見表2。2、3、4、5、6、8號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)的試管苗生長(zhǎng)明顯大于1 cm，適宜四棱石斛試管苗生長(zhǎng)，其中，5號(hào)培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀況最好，葉片繁密茂盛，優(yōu)于其他組，詳見圖1、圖2。因此，可以確定最適合四棱石斛生長(zhǎng)的激素濃度配比方案如下：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+6.5 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+2 g/L活性炭。在接下來(lái)的水楊酸調(diào)節(jié)四棱石斛生長(zhǎng)的試驗(yàn)中將應(yīng)用此組激素濃度配比方案。

表2 不同激素調(diào)節(jié)下四棱石斛試管苗的生長(zhǎng)狀況

注：“+”代表長(zhǎng)勢(shì)一般；“++”代表長(zhǎng)勢(shì)良好；“+++”代表長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)；“++++”代表長(zhǎng)勢(shì)最好。表3同。

2.2 不同濃度水楊酸處理下四棱石斛生長(zhǎng)狀況的研究

培養(yǎng)60 d內(nèi)不同濃度水楊酸處理下四棱石斛試管苗的生長(zhǎng)狀況見表3。培養(yǎng)15 d時(shí)試管苗生長(zhǎng)情況無(wú)明顯變化，種苗矮小，葉色較淺，培養(yǎng)30 d時(shí)長(zhǎng)勢(shì)較為明顯，種苗長(zhǎng)高，培養(yǎng) 45 d 時(shí)試管苗長(zhǎng)勢(shì)更好，其中第2組優(yōu)于其他組，培養(yǎng)60 d時(shí)第2組試管苗長(zhǎng)勢(shì)最好，葉色變?yōu)樯罹G色，生長(zhǎng)狀況茂密繁多。第2組在培養(yǎng)60 d時(shí)四棱石斛試管苗的長(zhǎng)勢(shì)見圖3。

2.3 水楊酸對(duì)四棱石斛試管苗多糖含量的影響

2.3.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖，用苯酚-濃硫酸法測(cè)定其含量，如果測(cè)定數(shù)據(jù)不在測(cè)量范圍內(nèi)，可以進(jìn)行稀釋或者濃縮來(lái)調(diào)至測(cè)量范圍，測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2.608 7x-0.000 6，r2=0.999 3(y表示吸光度；x表示濃度，μg/mL)，詳見圖4。

表3 不同水楊酸配比下四棱石斛的生長(zhǎng)狀況

2.3.2 多糖含量測(cè)定結(jié)果 多糖含量=[上清液體積(mL)×稀釋倍數(shù)×多糖濃度(μg/mL)]/質(zhì)量(mg)×100%。上清液體積為2次水提分離的體積總和；稀釋倍數(shù)分別為10、20、30，目的是使數(shù)據(jù)達(dá)到測(cè)量范圍。經(jīng)過60 d的生長(zhǎng)， 測(cè)量結(jié)果以稀釋10倍為準(zhǔn)， 稀釋20、30 倍的數(shù)據(jù)不在測(cè)量范圍內(nèi)，應(yīng)舍棄。不同發(fā)育階段、 不同水楊酸濃度下四棱石斛試管苗多糖含量見表4。結(jié)果表明，經(jīng)過60 d的培養(yǎng)處理，多糖含量達(dá)到最高值，水楊酸對(duì)四棱石斛多糖的合成具有促進(jìn)作用，其中濃度為 20 μmol/L 的水楊酸促進(jìn)作用最明顯。因此可知，最適宜試管苗生長(zhǎng)并促進(jìn)多糖合成的培養(yǎng)基是MS+1.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+6.5 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+2 g/L活性炭+20 μmol/L水楊酸。

表4 不同水楊酸濃度下四棱石斛多糖含量

3 討論與結(jié)論

3.1 不同激素濃度對(duì)四棱石斛試管苗生長(zhǎng)的影響

激素6-BA可以促進(jìn)細(xì)胞分裂并且可以誘導(dǎo)芽的分化，而NAA則主要誘導(dǎo)植物細(xì)胞的分裂[11]。試管苗的分化和增殖不僅被單一激素的濃度所影響，還與激素種類、濃度配比有關(guān)，不同的NAA、6-BA濃度配比可以對(duì)石斛試管苗生長(zhǎng)產(chǎn)生不同影響。過低濃度的NAA、6-BA并不能對(duì)植株的快繁產(chǎn)生明顯影響，而較高濃度的激素也會(huì)對(duì)植株的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。蔣向輝等采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法探討不同激素與濃度組合對(duì)鐵皮石斛愈傷誘導(dǎo)、芽分化與根誘導(dǎo)的影響，結(jié)果表明，合適的6-BA與NAA配比可誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽[12]。宋順等研究了激素對(duì)鐵皮石斛試管苗生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，當(dāng)NAA ∶6-BA為1 ∶5時(shí)，鐵皮石斛分化率達(dá)80%[13]。本試驗(yàn)也證明了這點(diǎn)，只有在適宜的濃度范圍內(nèi)(1.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA)，四棱石斛試管苗的快速繁殖才會(huì)產(chǎn)生最好的效果。在本研究中，最適合四棱石斛生長(zhǎng)的激素濃度配比的方案為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+6.5 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+2 g/L活性炭。

3.2 不同濃度水楊酸對(duì)四棱石斛試管苗生長(zhǎng)的影響

研究表明，水楊酸能夠在多種植物的抗非生物脅迫和抗病方面起作用[6]，但是水楊酸在對(duì)四棱石斛的調(diào)節(jié)方面的研究尚未見報(bào)道。王靜等以鐵皮石斛為材料，通過外施不同濃度的水楊酸，檢測(cè)其有關(guān)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、脯氨酸、葉綠素a、可溶性糖、葉綠素b和蛋白質(zhì)含量，從而為選擇適宜濃度的水楊酸、從生理角度提高鐵皮石斛的產(chǎn)量提供理論依據(jù)[14]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，水楊酸確實(shí)對(duì)四棱石斛試管苗的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，同期對(duì)照下分化苗更多，生長(zhǎng)更茂密，這一研究結(jié)果可為四棱石斛大批量生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

3.3 不同濃度水楊酸對(duì)四棱石斛試管苗多糖含量的影響

多糖類成分是石斛中具有抗腫瘤作用和促進(jìn)免疫的成分。近年來(lái)，對(duì)于石斛屬次生代謝產(chǎn)物積累情況的研究，主要集中在通過改變培養(yǎng)條件去提高石斛次生代謝產(chǎn)物量。研究表明，誘導(dǎo)子濃度在一定范圍內(nèi)對(duì)石斛類胞內(nèi)多糖的合成具有顯著的促進(jìn)作用[15]。水楊酸是一種特殊的生理生化信號(hào)，在石斛次生代謝過程中，能有選擇性、專一和快速地誘導(dǎo)一些特定基因的翻譯表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞中代謝產(chǎn)物的合成[16]。也可能因?yàn)樗畻钏徇€具有抗氧化的重要作用，充分為細(xì)胞提供良好的代謝環(huán)境，從而促進(jìn)細(xì)胞多糖合成。王博等研究表明，水楊酸的濃度控制在50～150 μmol/L范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有明顯影響，但是可以明顯促進(jìn)多糖合成[8]。本試驗(yàn)研究不同濃度水楊酸對(duì)四棱石斛試管苗多糖含量的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)水楊酸濃度在20 μmol/L時(shí)，多糖含量達(dá)到最高值，這為擴(kuò)大藥源和開發(fā)新藥提供了更多的理論依據(jù)。

[1]吉占和. 中國(guó)植物志[M]. 北京：科學(xué)出版社，1999.

[2]林 萍，畢志明，徐 紅，等. 石斛屬植物藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中草藥，2003，34(11)：附19-附22.

[3]朱 華，黃學(xué)萃，楊海廣，等. 石斛屬多糖的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)導(dǎo)報(bào)，2007，26(12)：1476-1479.

[4]顧慧芬，忻曉君，周文婷，等. 鐵皮石斛試管苗快速生長(zhǎng)與栽培研究及多糖含量測(cè)定[J]. 中成藥，1999，21(12)：658-659.

[5]高建平，金若敏，吳耀平，等. 鐵皮石斛原球莖與原藥材免疫調(diào)節(jié)作用的比較研究[J]. 中藥材，2002，25(7)：487-489.

[6]Raskin I. Role of salicylic acid in plants[J]. Ann Rev Plant Physiol Mol Biol，1992，43：439-463.

[7]Khodary S E A. Effect of salicylic acid on the growth，photosynthesis and carbohydrate metabolism in salt-stressed maize plants[J]. Int J Agri Biol，2004，6(1)：5-8.

[8]王 博，潘利華，羅建平，等. 水楊酸對(duì)霍山石斛類原球莖細(xì)胞生長(zhǎng)及多糖合成的影響[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2009，25(7)：1062-1068.

[9]Zhong J J，Wang D J. Improvement of cell growth and production of ginseng saponin and polysaccharide in suspension cultures of Panaxnotoginseng： Cu2+effect[J]. Journal of Biotechnology，1996，46(1)：69-72.

[10]李滿飛，平田義正. 中藥石斛類多糖的含量測(cè)定[J]. 中草藥，1990，21(10)：10-12.

[11]李 瑩. 鐵皮石斛組培及次生代謝物積累規(guī)律的研究[D]. 南京：南京林業(yè)大學(xué)，2012：6.

[12]蔣向輝，佘朝文，王善粉，等. 不同激素濃度對(duì)鐵皮石斛高效快繁體系的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(1)：76-78.

[13]宋 順，許 奕，王必尊，等. 不同培養(yǎng)基成分對(duì)鐵皮石斛組織培養(yǎng)的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29(13)：133-139

[14]王 靜，吳澤芳，唐小利，等. 水楊酸對(duì)鐵皮石斛幼苗部分生理指標(biāo)的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(1)：75-76，79.

[15]洪薩麗. 誘導(dǎo)子對(duì)霍山石斛懸浮培養(yǎng)原球莖生長(zhǎng)和生物堿的影響[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009：6-7.

[16]孟雪嬌，邸 昆，丁國(guó)華. 水楊酸在植物體內(nèi)的生理作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26(15)：207-214.