張 蕾， 艾 嘉， 韓毅強(qiáng)， 王彥杰， 晏 磊， 高亞梅， 王偉東

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163319)

卵菌是色菌界(Chromista)中一類二倍體真核微生物，包括許多重要的植物病原菌[1]。卵菌的寄主范圍很廣，其中包括蔬菜、果樹、中藥材、花卉、棉、麻、油料等重要經(jīng)濟(jì)作物。由卵菌引起的植物病害大多難以控制，尤其是霜霉菌(霜霉病)和疫霉菌(疫病)潛伏期短，再侵染次數(shù)多，常暴發(fā)流行而導(dǎo)致?lián)p失嚴(yán)重[2]。卵菌在進(jìn)化上與真菌相差很遠(yuǎn)，進(jìn)化上的差異使得疫霉菌擁有一套與其他真菌不同的致病機(jī)制，多數(shù)殺菌劑對(duì)植物疫病無效。大豆疫霉屬(Phytophthorasojae)屬于卵菌門的疫霉菌屬，是大豆根腐病的主要病原菌之一，能在任何一個(gè)時(shí)間點(diǎn)使大豆染病，包括大豆的種子發(fā)育期。盡管包括大豆疫霉在內(nèi)已有多個(gè)疫霉菌完成了基因組測序，但疫霉菌遺傳轉(zhuǎn)化困難，對(duì)疫霉菌與植物互作以及致病機(jī)理、基因功能等的研究進(jìn)展緩慢[3]。

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)，是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，其ATP 結(jié)合口袋位于較短的 N 端(β片層) 和較長的 C端(α-螺旋)之間的“葉狀” 深裂，調(diào)控ATP或底物與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的特異性結(jié)合[4]。細(xì)胞周期蛋白(cyclin)屬于細(xì)胞周期的正調(diào)控蛋白，具有組織特異性和種屬特異性[5]。CDK與細(xì)胞周期蛋白以非共價(jià)鍵結(jié)合形成復(fù)合物，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)和降解，參與酶的調(diào)節(jié)并維持細(xì)胞周期有序進(jìn)行，其中CDK為催化亞基，細(xì)胞周期蛋白為調(diào)控亞基。不同的細(xì)胞周期蛋白-CDK復(fù)合物具有不同的生物學(xué)功能，并通過CDK的底物磷酸化，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期不同時(shí)期的推進(jìn)和轉(zhuǎn)化[6-7]。完整的細(xì)胞周期過程受多種蛋白酶的調(diào)控，在動(dòng)物細(xì)胞中，調(diào)控失調(diào)則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖引發(fā)腫瘤，而通過抑制CDK的活性則可以抑制細(xì)胞的增殖[8]。目前，已經(jīng)篩選到了很多CDK的抑制劑。在酵母的研究中發(fā)現(xiàn)，勃利霉素可以抑制Cdc28[9]。大豆疫霉同樣受勃利霉素的強(qiáng)烈抑制，但勃利霉素是否影響其CDK蛋白還不清楚。

本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)大豆疫霉細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶進(jìn)行分析，為大豆疫霉細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶更加深入的功能研究及其抑制劑的篩選提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 大豆疫霉基因組內(nèi)CDK蛋白搜索

利用CDK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域在大豆疫霉基因組數(shù)據(jù)Joint Genome InstitutePhytophthorasojaedatabase v.1.1進(jìn)行序列比對(duì)分析，篩選獲得大豆疫霉基因組包含的CDK蛋白，在蛋白激酶數(shù)據(jù)庫kinase.com利用BLAST程序分析確定其所屬類型，對(duì)其進(jìn)行分類。

1.2 大豆疫霉psCdc2與酵母Cdc28同源性分析

所有預(yù)測到的細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶與酵母的細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶Cdc28蛋白質(zhì)序列的氨基酸序列用MEGA[10]進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，建樹方法采用鄰接法(neighbor-joining method)。系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的穩(wěn)健性通過 1 000 次自舉法檢驗(yàn)。將蛋白序列提交到CDD[11]進(jìn)行保守區(qū)域預(yù)測，并預(yù)測其功能活性位點(diǎn)。將與酵母Cdc28高度同源的基因的轉(zhuǎn)錄序列提交到疫霉數(shù)據(jù)庫的BLAST程序，數(shù)據(jù)庫選擇為SANGER EST，搜索EST序列。

1.3 大豆疫霉細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶psCdc2的生物信息分析

在Expasy網(wǎng)站(www.expasy.org)利用ProtParam分析大豆疫霉細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶psCdc2蛋白的基本特征，提交序列后，參數(shù)默認(rèn)進(jìn)行分析。利用ProtScale 程序分析蛋白質(zhì)的親疏水性，參數(shù)默認(rèn)。利用Signal P程序[12]分析該蛋白是否含有信號(hào)肽，在organism group選項(xiàng)中選擇真核生物，其他參數(shù)默認(rèn)。利用TMHMM[13](http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用ProtComp[14](http：//www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan & group=programs&subgroup=proloc)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；利用GOR4[15](https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)預(yù)測該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用Expasy 提供的SWISSMODEL軟件對(duì)該蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬，選擇自動(dòng)模擬。在STRING數(shù)據(jù)庫[16]利用酵母Cdc28蛋白進(jìn)行搜索獲得相互作用蛋白，在NCBI數(shù)據(jù)庫獲得其對(duì)應(yīng)的核酸序列，利用NCBI的BLASTN在大豆疫霉基因組內(nèi)進(jìn)行相似性搜索，獲得對(duì)應(yīng)的同源蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆疫霉基因組內(nèi)的細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶

在大豆疫霉基因組共發(fā)現(xiàn)11個(gè)CDK家族蛋白，在蛋白激酶數(shù)據(jù)庫對(duì)其進(jìn)行分類，將其歸為CDC2、CDC7、CDC8、CRK7等(表1)，對(duì)CDK蛋白保守序列分析表明其均為蛋白激酶超家族(PKc-like superfamily)。

表1 大豆疫霉基因組內(nèi)CDK家族蛋白

2.2 大豆疫霉的細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶Cdc28/Cln2同源基因

大豆疫霉psCdc2(PHYSODRAFT_352011)與酵母Cdc28高度同源，兩者蛋白質(zhì)序列的一致性百分比為66%，相似性百分比為80%，在進(jìn)化樹的同一分支(圖1)。大豆疫霉基因組數(shù)據(jù)庫對(duì)其進(jìn)行了初步注釋，初級(jí)轉(zhuǎn)錄物長度1 153 bp，編碼區(qū)CDS為930 bp，多肽鏈為309個(gè)氨基酸，基因包含1個(gè)內(nèi)含子。

利用保守結(jié)構(gòu)域分析大豆疫霉psCdc2(PHYSODRAFT_352011)表明其包含特異性的細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶的結(jié)構(gòu)域(圖2)，與酵母Cdc28蛋白的保守結(jié)構(gòu)域高度相似。其主要的結(jié)構(gòu)域是STKc_CDK1_like，它包括其完成功能的活性位點(diǎn)：ATP結(jié)合位點(diǎn)17個(gè)，分別為V(10)G(11)E(12)G(13)A(31)K(33)V(65)F(81)E(82)F(83)V(84)D(87)R(90)Q(131)N(132) L(134)D(145)；底物結(jié)合位點(diǎn)27個(gè)，分別為I(11)G(12)E(13)G(14)V(19)A(32)K(34)R(51)V(65) F(81)E(82)F(83)V(84)D(87)K(129)Q(131)N(132)L(134)D(145)L(148)T(160)E(162)V(163)T(165)W(167)G(205)D(206)。活性環(huán)(A-loop)包含24個(gè)氨基酸，位于144～167之間，氨基酸序列為GDFGLAREYGVPLRR YTHEVVTLW；CDK/cyclin相互作用界面包括12個(gè)氨基酸，分別為L(36)E(41)G(42)I(43) S(45)M(48)R(49)I(51)S(52)K(55)E(56)Y(74)。該結(jié)構(gòu)域在數(shù)據(jù)庫中的注釋為細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白1-類似的絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinases，STKs)催化結(jié)構(gòu)域。絲氨酸/蘇氨酸激酶催化ATP的γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的絲氨酸/蘇氨酸殘基。依據(jù)上述對(duì)大豆疫霉psCdc2(PHYSODRAFT_35201)序列的詳細(xì)分析，認(rèn)為其為酵母Cdc28的同源基因，具有相似的細(xì)胞周期調(diào)控的功能(圖3)。在蛋白激酶數(shù)據(jù)庫確定其為CMGC/CDK/CDC2C，與CDK2_Hsa相似性為82%，一致性百分比為66%，E值為10-114。

2.3 大豆疫霉psCdc2(PHYSODRAFT_352011)蛋白基本特征分析

對(duì)大豆疫霉細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶psCdc2蛋白的基本特征進(jìn)行分析。該蛋白由20種氨基酸組成，其中亮氨酸與纈氨酸含量最高，不含有吡咯賴氨酸(Pyl)與硒半胱氨酸(Sec)。使用TMHMM工具進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。使用ProtComp分析工具進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位分析，結(jié)果顯示該蛋白都主要分布在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)。ProtParam分析結(jié)果顯示，該蛋白分子量為35 478 u，等電點(diǎn)為8.56。該蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的半衰期大于10 h，酵母體內(nèi)的半衰期大于20 h，屬于穩(wěn)定存在蛋白。蛋白的脂肪族系數(shù)為92.72，ProtScale程序的親疏水性分析表明其親水性略強(qiáng)(圖4)。信號(hào)肽分析程序Signal P分析結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)無信號(hào)肽(圖5)。

利用二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件GOR4預(yù)測該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組件為α螺旋占32%，β折疊占15%，無規(guī)則卷曲為53%，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果見圖6-A。預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)見圖6-B，其為單體結(jié)構(gòu)，屬于α/β型蛋白。

在STRING 數(shù)據(jù)庫中利用酵母Cdc28基因進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)有10個(gè)蛋白與Cdc28基因存在相互作用，形成復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)(圖7)。

利用BLAST在大豆疫霉基因組內(nèi)對(duì)這些同源基因進(jìn)行搜索，找到了全部的10個(gè)同源蛋白(表2)， 蛋白的一致性百分比在26%～46%，說明在大豆疫霉基因組內(nèi)可能同樣存在它們之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期過程。

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶是細(xì)胞周期順利進(jìn)行的催化劑，很多研究表明細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶家族是高度復(fù)雜的[17-19]。細(xì)胞周期的形成過程中，需要通過精密調(diào)控姐妹染色體的分離、紡錘體的形成以及細(xì)胞骨架構(gòu)建，從而達(dá)到在時(shí)間和空間上高度協(xié)調(diào)一致，使得整個(gè)進(jìn)程順利進(jìn)行。目前已經(jīng)在致病疫霉中發(fā)現(xiàn)，在游動(dòng)孢子囊的形成起著重要調(diào)控作用的PiCdc14基因，在菌絲生長階段并不轉(zhuǎn)錄，只在游動(dòng)孢子囊形成階段特異地轉(zhuǎn)錄[20]。在大豆疫霉基因組中找到了它的同源基因PsCdc14基因，該基因在游動(dòng)孢子囊形成的過程中發(fā)揮著同樣的作用[21]。該基因與致病疫霉中的PiCdc14基因具有相似的轉(zhuǎn)錄模式，在游動(dòng)孢子囊產(chǎn)生階段、游動(dòng)孢子階段和休止孢階段上調(diào)表達(dá)。在本研究中通過對(duì)大豆疫霉基因組進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)了大豆疫霉中有11個(gè)CDK家族蛋白，對(duì)其中大豆疫霉psCdc2基因進(jìn)行研究與功能預(yù)測，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

在酵母研究中發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶Cdc28/Cln2的有效抑制劑勃利霉素，可以抑制酵母的細(xì)胞周期，導(dǎo)致細(xì)胞停留在G1期，不能進(jìn)行RNA和蛋白質(zhì)的生物合成，不能夠進(jìn)入下一階段S期[9，22]。勃利霉素在酵母中通過蘇氨酰tRNA合成酶和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白2條途徑發(fā)揮作用。目前的研究發(fā)現(xiàn)，在大豆疫霉中勃利霉素也能通過蘇氨酰tRNA合成酶途徑發(fā)揮作用[22-23]，在對(duì)大豆疫霉psCdc2與酵母Cdc28進(jìn)行比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩者高度同源，在進(jìn)化樹的同一分支，且兩者蛋白的保守結(jié)構(gòu)域高度相似，確定了大豆疫霉psCdc2中的細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白1-類似的絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinases，STKs)催化結(jié)構(gòu)域的主要結(jié)構(gòu)域STKc_CDK1_like，說明其具有與酵母相似的調(diào)控細(xì)胞周期的功能。對(duì)酵母Cdc28基因分析中，共發(fā)現(xiàn)有10個(gè)蛋白與Cdc28基因存在相互作用，并在大豆疫霉基因組找到其全部同源蛋白。由此推測勃利霉素對(duì)疫霉的細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶也存在抑制作用，為勃利霉素抗卵菌的多途徑作用機(jī)理研究提供依據(jù)與參考。

表2 大豆疫霉基因組內(nèi)與酵母Cdc28基因相互作用蛋白的同源蛋白

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