張 蕾， 艾 嘉， 韓毅強(qiáng)， 王彥杰， 晏 磊， 高亞梅， 王偉東

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163319)

卵菌是色菌界(Chromista)中一類(lèi)二倍體真核微生物，包括許多重要的植物病原菌[1]。卵菌的寄主范圍很廣，其中包括蔬菜、果樹(shù)、中藥材、花卉、棉、麻、油料等重要經(jīng)濟(jì)作物。由卵菌引起的植物病害大多難以控制，尤其是霜霉菌(霜霉病)和疫霉菌(疫病)潛伏期短，再侵染次數(shù)多，常暴發(fā)流行而導(dǎo)致?lián)p失嚴(yán)重[2]。卵菌在進(jìn)化上與真菌相差很遠(yuǎn)，進(jìn)化上的差異使得疫霉菌擁有一套與其他真菌不同的致病機(jī)制，多數(shù)殺菌劑對(duì)植物疫病無(wú)效。大豆疫霉屬(Phytophthorasojae)屬于卵菌門(mén)的疫霉菌屬，是大豆根腐病的主要病原菌之一，能在任何一個(gè)時(shí)間點(diǎn)使大豆染病，包括大豆的種子發(fā)育期。盡管包括大豆疫霉在內(nèi)已有多個(gè)疫霉菌完成了基因組測(cè)序，但疫霉菌遺傳轉(zhuǎn)化困難，對(duì)疫霉菌與植物互作以及致病機(jī)理、基因功能等的研究進(jìn)展緩慢[3]。

細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)，是一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶，其ATP 結(jié)合口袋位于較短的 N 端(β片層) 和較長(zhǎng)的 C端(α-螺旋)之間的“葉狀” 深裂，調(diào)控ATP或底物與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶的特異性結(jié)合[4]。細(xì)胞周期蛋白(cyclin)屬于細(xì)胞周期的正調(diào)控蛋白，具有組織特異性和種屬特異性[5]。CDK與細(xì)胞周期蛋白以非共價(jià)鍵結(jié)合形成復(fù)合物，并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)和降解，參與酶的調(diào)節(jié)并維持細(xì)胞周期有序進(jìn)行，其中CDK為催化亞基，細(xì)胞周期蛋白為調(diào)控亞基。不同的細(xì)胞周期蛋白-CDK復(fù)合物具有不同的生物學(xué)功能，并通過(guò)CDK的底物磷酸化，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期不同時(shí)期的推進(jìn)和轉(zhuǎn)化[6-7]。完整的細(xì)胞周期過(guò)程受多種蛋白酶的調(diào)控，在動(dòng)物細(xì)胞中，調(diào)控失調(diào)則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖引發(fā)腫瘤，而通過(guò)抑制CDK的活性則可以抑制細(xì)胞的增殖[8]。目前，已經(jīng)篩選到了很多CDK的抑制劑。在酵母的研究中發(fā)現(xiàn)，勃利霉素可以抑制Cdc28[9]。大豆疫霉同樣受勃利霉素的強(qiáng)烈抑制，但勃利霉素是否影響其CDK蛋白還不清楚。

本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)大豆疫霉細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶進(jìn)行分析，為大豆疫霉細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶更加深入的功能研究及其抑制劑的篩選提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 大豆疫霉基因組內(nèi)CDK蛋白搜索

利用CDK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域在大豆疫霉基因組數(shù)據(jù)Joint Genome InstitutePhytophthorasojaedatabase v.1.1進(jìn)行序列比對(duì)分析，篩選獲得大豆疫霉基因組包含的CDK蛋白，在蛋白激酶數(shù)據(jù)庫(kù)kinase.com利用BLAST程序分析確定其所屬類(lèi)型，對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)。

1.2 大豆疫霉psCdc2與酵母Cdc28同源性分析

所有預(yù)測(cè)到的細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶與酵母的細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶Cdc28蛋白質(zhì)序列的氨基酸序列用MEGA[10]進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，建樹(shù)方法采用鄰接法(neighbor-joining method)。系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的穩(wěn)健性通過(guò) 1 000 次自舉法檢驗(yàn)。將蛋白序列提交到CDD[11]進(jìn)行保守區(qū)域預(yù)測(cè)，并預(yù)測(cè)其功能活性位點(diǎn)。將與酵母Cdc28高度同源的基因的轉(zhuǎn)錄序列提交到疫霉數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST程序，數(shù)據(jù)庫(kù)選擇為SANGER EST，搜索EST序列。

1.3 大豆疫霉細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白激酶psCdc2的生物信息分析

在Expasy網(wǎng)站(www.expasy.org)利用ProtParam分析大豆疫霉細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白激酶psCdc2蛋白的基本特征，提交序列后，參數(shù)默認(rèn)進(jìn)行分析。利用ProtScale 程序分析蛋白質(zhì)的親疏水性，參數(shù)默認(rèn)。利用Signal P程序[12]分析該蛋白是否含有信號(hào)肽，在organism group選項(xiàng)中選擇真核生物，其他參數(shù)默認(rèn)。利用TMHMM[13](http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用ProtComp[14](http：//www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan & group=programs&subgroup=proloc)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；利用GOR4[15](https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)預(yù)測(cè)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用Expasy 提供的SWISSMODEL軟件對(duì)該蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬，選擇自動(dòng)模擬。在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)[16]利用酵母Cdc28蛋白進(jìn)行搜索獲得相互作用蛋白，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得其對(duì)應(yīng)的核酸序列，利用NCBI的BLASTN在大豆疫霉基因組內(nèi)進(jìn)行相似性搜索，獲得對(duì)應(yīng)的同源蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆疫霉基因組內(nèi)的細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白激酶

在大豆疫霉基因組共發(fā)現(xiàn)11個(gè)CDK家族蛋白，在蛋白激酶數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)，將其歸為CDC2、CDC7、CDC8、CRK7等(表1)，對(duì)CDK蛋白保守序列分析表明其均為蛋白激酶超家族(PKc-like superfamily)。

表1 大豆疫霉基因組內(nèi)CDK家族蛋白

2.2 大豆疫霉的細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶Cdc28/Cln2同源基因

大豆疫霉psCdc2(PHYSODRAFT_352011)與酵母Cdc28高度同源，兩者蛋白質(zhì)序列的一致性百分比為66%，相似性百分比為80%，在進(jìn)化樹(shù)的同一分支(圖1)。大豆疫霉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行了初步注釋?zhuān)跫?jí)轉(zhuǎn)錄物長(zhǎng)度1 153 bp，編碼區(qū)CDS為930 bp，多肽鏈為309個(gè)氨基酸，基因包含1個(gè)內(nèi)含子。

利用保守結(jié)構(gòu)域分析大豆疫霉psCdc2(PHYSODRAFT_352011)表明其包含特異性的細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶的結(jié)構(gòu)域(圖2)，與酵母Cdc28蛋白的保守結(jié)構(gòu)域高度相似。其主要的結(jié)構(gòu)域是STKc_CDK1_like，它包括其完成功能的活性位點(diǎn)：ATP結(jié)合位點(diǎn)17個(gè)，分別為V(10)G(11)E(12)G(13)A(31)K(33)V(65)F(81)E(82)F(83)V(84)D(87)R(90)Q(131)N(132) L(134)D(145)；底物結(jié)合位點(diǎn)27個(gè)，分別為I(11)G(12)E(13)G(14)V(19)A(32)K(34)R(51)V(65) F(81)E(82)F(83)V(84)D(87)K(129)Q(131)N(132)L(134)D(145)L(148)T(160)E(162)V(163)T(165)W(167)G(205)D(206)。活性環(huán)(A-loop)包含24個(gè)氨基酸，位于144～167之間，氨基酸序列為GDFGLAREYGVPLRR YTHEVVTLW；CDK/cyclin相互作用界面包括12個(gè)氨基酸，分別為L(zhǎng)(36)E(41)G(42)I(43) S(45)M(48)R(49)I(51)S(52)K(55)E(56)Y(74)。該結(jié)構(gòu)域在數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋為細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白1-類(lèi)似的絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinases，STKs)催化結(jié)構(gòu)域。絲氨酸/蘇氨酸激酶催化ATP的γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的絲氨酸/蘇氨酸殘基。依據(jù)上述對(duì)大豆疫霉psCdc2(PHYSODRAFT_35201)序列的詳細(xì)分析，認(rèn)為其為酵母Cdc28的同源基因，具有相似的細(xì)胞周期調(diào)控的功能(圖3)。在蛋白激酶數(shù)據(jù)庫(kù)確定其為CMGC/CDK/CDC2C，與CDK2_Hsa相似性為82%，一致性百分比為66%，E值為10-114。

2.3 大豆疫霉psCdc2(PHYSODRAFT_352011)蛋白基本特征分析

對(duì)大豆疫霉細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶psCdc2蛋白的基本特征進(jìn)行分析。該蛋白由20種氨基酸組成，其中亮氨酸與纈氨酸含量最高，不含有吡咯賴(lài)氨酸(Pyl)與硒半胱氨酸(Sec)。使用TMHMM工具進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。使用ProtComp分析工具進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位分析，結(jié)果顯示該蛋白都主要分布在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)。ProtParam分析結(jié)果顯示，該蛋白分子量為35 478 u，等電點(diǎn)為8.56。該蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的半衰期大于10 h，酵母體內(nèi)的半衰期大于20 h，屬于穩(wěn)定存在蛋白。蛋白的脂肪族系數(shù)為92.72，ProtScale程序的親疏水性分析表明其親水性略強(qiáng)(圖4)。信號(hào)肽分析程序Signal P分析結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)無(wú)信號(hào)肽(圖5)。

利用二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件GOR4預(yù)測(cè)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組件為α螺旋占32%，β折疊占15%，無(wú)規(guī)則卷曲為53%，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6-A。預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖6-B，其為單體結(jié)構(gòu)，屬于α/β型蛋白。

在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中利用酵母Cdc28基因進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)有10個(gè)蛋白與Cdc28基因存在相互作用，形成復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)(圖7)。

利用BLAST在大豆疫霉基因組內(nèi)對(duì)這些同源基因進(jìn)行搜索，找到了全部的10個(gè)同源蛋白(表2)， 蛋白的一致性百分比在26%～46%，說(shuō)明在大豆疫霉基因組內(nèi)可能同樣存在它們之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期過(guò)程。

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶是細(xì)胞周期順利進(jìn)行的催化劑，很多研究表明細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶家族是高度復(fù)雜的[17-19]。細(xì)胞周期的形成過(guò)程中，需要通過(guò)精密調(diào)控姐妹染色體的分離、紡錘體的形成以及細(xì)胞骨架構(gòu)建，從而達(dá)到在時(shí)間和空間上高度協(xié)調(diào)一致，使得整個(gè)進(jìn)程順利進(jìn)行。目前已經(jīng)在致病疫霉中發(fā)現(xiàn)，在游動(dòng)孢子囊的形成起著重要調(diào)控作用的PiCdc14基因，在菌絲生長(zhǎng)階段并不轉(zhuǎn)錄，只在游動(dòng)孢子囊形成階段特異地轉(zhuǎn)錄[20]。在大豆疫霉基因組中找到了它的同源基因PsCdc14基因，該基因在游動(dòng)孢子囊形成的過(guò)程中發(fā)揮著同樣的作用[21]。該基因與致病疫霉中的PiCdc14基因具有相似的轉(zhuǎn)錄模式，在游動(dòng)孢子囊產(chǎn)生階段、游動(dòng)孢子階段和休止孢階段上調(diào)表達(dá)。在本研究中通過(guò)對(duì)大豆疫霉基因組進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)了大豆疫霉中有11個(gè)CDK家族蛋白，對(duì)其中大豆疫霉psCdc2基因進(jìn)行研究與功能預(yù)測(cè)，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

在酵母研究中發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶Cdc28/Cln2的有效抑制劑勃利霉素，可以抑制酵母的細(xì)胞周期，導(dǎo)致細(xì)胞停留在G1期，不能進(jìn)行RNA和蛋白質(zhì)的生物合成，不能夠進(jìn)入下一階段S期[9，22]。勃利霉素在酵母中通過(guò)蘇氨酰tRNA合成酶和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白2條途徑發(fā)揮作用。目前的研究發(fā)現(xiàn)，在大豆疫霉中勃利霉素也能通過(guò)蘇氨酰tRNA合成酶途徑發(fā)揮作用[22-23]，在對(duì)大豆疫霉psCdc2與酵母Cdc28進(jìn)行比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩者高度同源，在進(jìn)化樹(shù)的同一分支，且兩者蛋白的保守結(jié)構(gòu)域高度相似，確定了大豆疫霉psCdc2中的細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白1-類(lèi)似的絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinases，STKs)催化結(jié)構(gòu)域的主要結(jié)構(gòu)域STKc_CDK1_like，說(shuō)明其具有與酵母相似的調(diào)控細(xì)胞周期的功能。對(duì)酵母Cdc28基因分析中，共發(fā)現(xiàn)有10個(gè)蛋白與Cdc28基因存在相互作用，并在大豆疫霉基因組找到其全部同源蛋白。由此推測(cè)勃利霉素對(duì)疫霉的細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶也存在抑制作用，為勃利霉素抗卵菌的多途徑作用機(jī)理研究提供依據(jù)與參考。

表2 大豆疫霉基因組內(nèi)與酵母Cdc28基因相互作用蛋白的同源蛋白

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