朱欽士 （美國南加州大學醫(yī)學院）

（上接2018年第8期第18頁）

2.18 酵母細胞中的傳染性蛋白質(zhì) 酵母在一般情況下是單細胞的真核生物，與動物相比是較“原始”的，但酵母中存在傳染性蛋白的線索在半個世紀前就被發(fā)現(xiàn)了，比瘋牛病報道的年代（1986年）還早。1965年，英國科學家Brian Cox發(fā)現(xiàn)，出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）的一個“突變種”中，細胞對轉(zhuǎn)譯終止碼的識別出了問題，即肽鏈合成至mRNA上的轉(zhuǎn)譯終止碼（UAG和UAA）時，轉(zhuǎn)譯過程并未停止，而是繼續(xù)進行，好像核糖體對終止碼“視而不見”。在與腺嘌呤的合成有關(guān)的一個基團發(fā)生突變（ade2-1基因突變），在編碼序列中提前出現(xiàn)一個終止碼時，在正常情況下突變型酵母是不能合成完整的酶的，因為合成過程提前終止。由于這個酶功能的缺失，腺嘌呤合成過程中的中間產(chǎn)物就會在細胞中聚集，使得菌斑成為紅色，這個突變型酵母也必須從培養(yǎng)液中獲得腺嘌呤才能生長。而有終止碼識別問題的酵母會“忽略”此終止碼，生產(chǎn)出完整的酶，腺嘌呤的合成正常進行，菌斑為白色（因為沒有中間產(chǎn)物聚集），培養(yǎng)基里也不用添加腺嘌呤。

該終止碼識別缺失的特性還可遺傳，使得后代的所有酵母都擁有此特性。按照分子生物學的經(jīng)典理論，負責這個性狀遺傳的應(yīng)該是某個問題基因，即通過DNA遺傳，且是“顯性”（dominant）遺傳，即2份基因中只要有一份基因突變，后代就可獲得突變引起的性狀。Cox將酵母的這個性狀用希臘字母ψ標記，讀音為psi。然而對遺傳方式的研究結(jié)果卻與預期不符。例如將變種與正常的酵母雜交，后代應(yīng)該是一部分有終止碼識別問題，一部分沒有，但結(jié)果卻是雜交的所有后代都沒有終止碼識別問題，好像這個突變基因又變成了“隱性”（recessive）的，即需要2份基因都發(fā)生突變才表現(xiàn)突變癥狀。即酵母該性狀的遺傳方式與經(jīng)典的孟德爾遺傳方式不同，稱為“非孟德爾型遺傳”（non-Mendelian heredity）。

此現(xiàn)象讓科學家困惑了幾十年，即使在1982年P(guān)rusiner提出傳染性蛋白的概念之后，科學家仍然沒有想到酵母的異常遺傳現(xiàn)象可用傳染性蛋白進行解釋。直至1994年，美國科學家Reed B.Wickner才從傳染性蛋白致病的事實中得到啟發(fā)，發(fā)現(xiàn)了酵母的另一個性狀，即在氮源利用上的機制變化，也是由傳染性蛋白控制和遺傳的（見下文），由此開啟了酵母傳染性蛋白的研究。在這之后2年，即1996年，美國的Susan Lindquist等才證明酵母的psi性狀也是通過傳染性蛋白遺傳的?？茖W家用［PST+］表示此性狀，其中的大寫字母和正號表示“顯性”，而括弧表示“非孟德爾型遺傳”。沒有這個psi性狀的酵母則用小寫字母和負號［pst-］表示。

此遺傳不是通過DNA，而是通過細胞質(zhì)完成的。起遺傳作用的是一個稱為Sup35的蛋白質(zhì)改變折疊方式，變成了Prion型的結(jié)構(gòu)。在正常酵母細胞中，Sup35是水溶性的，并與另一個蛋白Sup45一起，識別mRNA上的轉(zhuǎn)譯終止碼，并將合成完成的肽鏈從核糖體上解離下來。類似ApoA-I蛋白能改變折疊狀況的氨基端，Sup35的氨基端也能改變折疊方式，變成Prion蛋白那樣的橫向β-折疊，進而形成聚合物。此聚合物能結(jié)合剛果紅，對聚合物的圓二色性（CD）測定表明其中富含β-折疊，說明其結(jié)構(gòu)和Prion蛋白類似。這個改變了折疊方式的Sup35蛋白，像PrPsc能將PrPc改變成自己的結(jié)構(gòu)一樣，也能將水溶性的Sup35改變成不溶于水的聚合物，即具有“傳染性”，最后使得酵母細胞中所有的Sup35都轉(zhuǎn)變成為聚合物而失去功能，使細胞不再能識別轉(zhuǎn)譯終止碼，其作用和Sup35的基因突變使Sup35蛋白喪失功能的效果是一樣的。

將提純的Sup35蛋白在體外變?yōu)榫酆衔?，再引入［psi-］型的酵母，可將［psi-］型的酵母變?yōu)椋跴ST+］型的酵母。當［PSI+］型的酵母與［pst-］型的酵母雜交時，［PSI+］細胞中的Sup35聚合物還會將［psi-］型酵母中的可溶性Sup35變?yōu)榫酆衔?。不僅如此，酵母細胞中的熱休克蛋白Hsp104還能將這些聚合物分為小塊，在細胞中均勻分布，在細胞繁殖時進入每一個后代細胞。因此在這里，Sup35蛋白的Prion形式不僅具有“傳染性”（即以可溶性Sup35蛋白為原料自我復制），它還具有“遺傳性”，在所有的后代細胞中出現(xiàn)，好像這個遺傳是“顯性”的。而Sup35基因突變的遺傳方式則是孟德爾型的隱性遺傳（需要2份基因突變才能使正常Sup35的功能消失）。

酵母的另一個傳染性蛋白是調(diào)節(jié)細胞氮代謝的蛋白Ure2p。在有優(yōu)質(zhì)氮源（例如氨和谷氨酰胺）時，Ure2p能抑制另一個蛋白Gln3p的作用，使得細胞在有優(yōu)質(zhì)氮源時不能使用低質(zhì)量的氮源（例如uredosuccinate，Ure2p的名稱的由來）。當Ure2p變成Prion形式，即變?yōu)闆]有正常功能的蛋白時，對Gln3p的抑制解除，細胞就可以在有優(yōu)質(zhì)氮源時也能使用低質(zhì)量的氮源。酵母的這種狀態(tài)被稱為［URE3］。

與Sup35蛋白和ApoA-I蛋白類似，Ure2p蛋白的氨基端也較易改變折疊狀況，形成Prion蛋白那樣的β-折疊結(jié)構(gòu)。提取的Ure2p片段（殘基1～65）可在試管中迅速形成小纖維。這些小纖維能被剛果紅染色，并在偏振光顯微鏡下呈蘋果綠的雙折射現(xiàn)象，說明與動物的傳染性蛋白形成的小纖維有類似的結(jié)構(gòu)。這樣形成的小纖維也能使全長的Ure2p蛋白改變折疊狀況，形成更粗的小纖維，說明該結(jié)構(gòu)能夠復制自己。［URE3］的性狀是遺傳性的，即可傳遞給下一代。此遺傳也需要Hsp104的參與。

酵母［PSI+］和［URE3］性狀的形成并不需要Sup35和Ure2p的基因突變，而是可以自然發(fā)生。5%的乙醇能極大增加這2個蛋白變成Prion類型蛋白的幾率。這些蛋白表達水平的升高也會使Prion型蛋白出現(xiàn)的幾率增加。與動物的傳染性蛋白對細胞有傷害性不同，［PSI+］和［URE3］的性狀能遺傳給后代，說明Sup35和Ure2p蛋白形成的Prion型聚合物對酵母細胞的害處并不大，甚至有人認為酵母中傳染性蛋白的形成，也許是酵母在不改變基因的DNA序列的情況下適應(yīng)某些不利生活條件的一種方法。

除Sup35和Ure2p蛋白，酵母的其他一些蛋白也可轉(zhuǎn)變?yōu)镻rion型的結(jié)構(gòu)，所以也屬于酵母的傳染性蛋白，例如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Mot3（modulator of transcription）可形成［MOT3+］，修改酵母轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）的蛋白Mod5（tRNA modification）可形成［MOD+］，改變酵母染色質(zhì)的蛋白SwiI可形成［SWI+］等。這些蛋白折疊方式的改變也導致酵母性狀的改變。

檢查酵母傳染性蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)容易形成Prion型結(jié)構(gòu)的功能域含有較多的谷氨酰胺和天冬酰胺殘基，而少有帶電的氨基酸側(cè)鏈。將功能域中的氨基酸序列打亂，隨機排列，功能域仍具有形成Prion型結(jié)構(gòu)的能力，說明不是具體的氨基酸序列，而是氨基酸的組成，是決定一段肽鏈是否容易（或者能夠）形成Prion型結(jié)構(gòu)的因素。造成人類杭廷頓氏癥的Huntingtin基因，就是增加了很多CAG重復序列，相當于在蛋白中增加了許多谷氨酰胺殘基，使其轉(zhuǎn)變?yōu)镻rion型結(jié)構(gòu)的可能性極大增加。

但不是所有的Prion型功能域都富含谷氨酰胺和天冬酰胺。例如引起阿茨海默癥的Aβ肽鏈就不富含這2種氨基酸，在42個氨基酸殘基中只含有1個谷氨酰胺和1個天冬酰胺殘基，且不少氨基酸殘基的側(cè)鏈含有帶電基團。即使酵母的傳染性蛋白Mod5也沒有富含這2種氨基酸的功能域，說明其他氨基酸組成的肽鏈區(qū)段也可能有形成Prion型結(jié)構(gòu)的能力。但是富含谷氨酰胺和天冬酰胺的特點，還是可以代表一部分傳染性蛋白的功能域，可用于搜尋其他蛋白中類似的功能域。在此思想指導下，Susan Lindquist編寫了用氨基酸組成預測肽鏈變?yōu)镻rion型結(jié)構(gòu)的程序，可用于檢測其他生物中的蛋白是否也含有類似的功能域。用該程序，科學家在細菌中也發(fā)現(xiàn)了傳染性蛋白。

2.19 肉毒桿菌中的傳染性蛋白Rho（ρ）如上所說，許多傳染性蛋白都有自己形成Prion型結(jié)構(gòu)的功能域，其中一些（特別是酵母的傳染性蛋白）富含谷氨酰胺和天冬酰胺。2017年，美國科學家Ann Hochschild用酵母的傳染性蛋白為模板，搜尋約6萬個細菌的基因組，發(fā)現(xiàn)肉毒桿菌（Clostridium botulinum）的Rho（代表希臘字母ρ）蛋白含有這樣的功能域（在殘基74～141）。

Rho蛋白，類似酵母的Sup35蛋白，也是負責終止基因表達的蛋白。Sup35的功能是與Sup45一起識別轉(zhuǎn)譯終止碼，使核糖體停止肽鏈的合成過程，并將新合成的肽鏈從核糖體釋放出來；而Rho蛋白以六聚體的形式，結(jié)合在新合成mRNA分子上，停止轉(zhuǎn)錄并釋放新合成的mRNA分子。

為證明此功能域確實能形成Prion型的結(jié)構(gòu)，Hochschild將 Rho的74～141片段、1～248片段（其中包含74～141片段），以及殘基1～73被除去的Rho片段（也含有74～141片段）表達在大腸桿菌中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3個片段都能形成Prion型的聚合物。這些聚合物能結(jié)合剛果紅，并在偏振光顯微鏡上呈現(xiàn)蘋果綠色的雙折射現(xiàn)象。相反，不含此功能域的Rho蛋白片段（例如殘基1～141被去掉），則不形成這樣的聚合物。

Rho蛋白變成Prion型的結(jié)構(gòu)后，理論上它終止轉(zhuǎn)錄過程的功能也應(yīng)消失。為證明這一點，Hochschild利用在大腸桿菌中的基因表達系統(tǒng)，將Rho的Prion功能域與大腸桿菌Rho蛋白的羧基端相連接，再觀察對“報告基因”（受某個啟動子操控，表達產(chǎn)物容易檢測的基因）表達的影響。結(jié)果表明，大腸桿菌會有2種狀態(tài)，報告基因高表達的狀態(tài)和低表達狀態(tài)，說明這樣的雜合Rho蛋白有2種功能狀態(tài)。從這2種大腸桿菌中提取的Rho蛋白表明，低表達細菌中的Rho處于聚合物的狀態(tài)，而高表達的Rho蛋白處于可溶狀態(tài)。

不僅如此，2種表達狀態(tài)不同的大腸桿菌還能以低概率相互轉(zhuǎn)化，說明Rho蛋白可在聚合狀態(tài)和可溶狀態(tài)間相互轉(zhuǎn)化。聚集狀態(tài)可長期在大腸桿菌中維持，在傳120代之后仍然保持聚集狀態(tài)，說明細菌的Rho蛋白不僅具有傳染性，且與酵母一樣具有遺傳性。

由于Rho蛋白是以酵母富含谷氨酰胺和天冬氨酸殘基的功能域為模板搜尋到的，細菌很可能還含有其他氨基酸殘基組成的功能域，例如像人類PrP蛋白的功能域和Aβ肽鏈那樣的功能域。

傳染性蛋白在細菌中被發(fā)現(xiàn)，說明形成Prion型結(jié)構(gòu)的蛋白功能域出現(xiàn)的時間非常之早，在原核生物和真核生物分開之前就發(fā)生了。傳染性蛋白改變折疊方式，進而聚合而喪失功能，也許是微生物適應(yīng)嚴酷環(huán)境的一種方式。例如Sup35和Rho蛋白變成Prion形式后，原來轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的功能消失，造成更長的mRNA和肽鏈的形成，在mRNA的穩(wěn)定性和蛋白的功能上都會發(fā)生改變，在一些環(huán)境條件下對生物的生存可能是有利的。這種方式不需要基因發(fā)生突變，而又能傳遞給后代，因此是對微生物有利的機制而得以保存。這種遺傳方式不同于通過DNA的基因遺傳，而是通過細胞質(zhì)中蛋白質(zhì)的遺傳。從這些蛋白質(zhì)的傳染性（復制自己的結(jié)構(gòu)）和遺傳性（能通過聚合物的形式傳給后代）這2個方面來看，蛋白質(zhì)里儲存的信息是可以被輸出的。

2.20 植物中的傳染性蛋白 使用自己編寫的搜尋Prion型功能域的程序，Lindquist搜尋了植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）的基因組，發(fā)現(xiàn)了474個擬南芥蛋白含有類似的Prion型的功能域。其中的3個蛋白與擬南芥開花控制有關(guān)，分別是LD（luminidependens）、FPA（Flowering Locus PA)和FCA（Flowering Locus CA）。其中LD是一個轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)PA和FCA是RNA結(jié)合蛋白。

為證明這些功能域的確能形成Prion類型的結(jié)構(gòu)，Lindquist將這些功能域與綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）融合在一起，在酵母中進行表達，發(fā)現(xiàn)這3個功能域都能形成淀粉樣聚合物。

將這3個功能域與酵母Sup35蛋白的羧基端融合在一起，在有Ade基因突變（即在編碼區(qū)中提前引入一個轉(zhuǎn)譯終止碼）的酵母中表達，發(fā)現(xiàn)它們能在部分酵母中使Sup35的羧基端喪失功能，使酵母能忽略該終止碼，合成完整的蛋白，說明這些功能域的確能發(fā)揮Prion結(jié)構(gòu)的作用，即使可溶性的蛋白喪失功能。有些酵母仍然不能忽略終止碼，說明有部分Sup35羧基端仍處于功能狀態(tài)，不因為與植物的Prion功能域融合就喪失功能，即植物蛋白的Prion功能域在酵母中也不完全形成Prion型的結(jié)構(gòu)。

同樣，由于這幾個蛋白是以酵母富含谷氨酰胺和天冬氨酸殘基的功能域為模板搜尋到的，植物很可能還含有其他氨基酸殘基組成的功能域。目前對植物傳染性蛋白的研究還很少，估計隨著研究的進展，會有更多的植物傳染性蛋白被發(fā)現(xiàn)。

2.21 傳染性蛋白有“光明面”嗎 從以上例子可以看出，蛋白肽鏈的折疊出現(xiàn)錯誤，形成Prion型的橫向β-折疊結(jié)構(gòu)，進而聚集形成淀粉樣沉積，是肽鏈在折疊過程中不可避免地要出現(xiàn)的問題。生物既然選擇了用氨基酸組建蛋白質(zhì)，就不能完全避免折疊狀態(tài)出問題的可能性。Prion型的結(jié)構(gòu)就像是一個“折疊陷阱”，一旦掉入此結(jié)構(gòu)，就很難再出來。不僅如此，開始形成的聚合物就像一個“黑洞”，不斷將周圍正常的蛋白“吸”入自己的結(jié)構(gòu)，讓自己長大，使得這種結(jié)構(gòu)的蛋白具有傳染性。

在形成Prion型的結(jié)構(gòu)時，由于蛋白分子的結(jié)構(gòu)改變，通常都會導致蛋白質(zhì)原先正常的生理功能喪失。不僅如此，在人和其他高等動物中，淀粉樣的沉積物，無論是在細胞內(nèi)還是在細胞外，幾乎對細胞都是有害的，導致各式各樣的淀粉樣變性病?，F(xiàn)在一提到傳染性蛋白，人們想到的都是它造成的可怕后果，即蛋白折疊方式改變所造成的后果總是負面的。Prion被譯為“朊病毒”，和疾病傳染源劃歸一類，就反映了這種情況。即使在酵母中，［PSI+］和［URE3］也被一些科學家看作是傳染性蛋白病。由于許多醫(yī)院并不進行淀粉樣病變的檢測工作（例如對需要透析和換腎的患者并不進行淀粉樣沉積的檢查），淀粉樣變性病的實際發(fā)生率估計要比已報道的為多。不過總的說來，淀粉樣變性病的發(fā)病率還是很低的，動物億萬年的演化，已最大限度地減少了蛋白折疊錯誤及其帶來的不良后果，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的淀粉樣變性病，是動物對肽鏈折疊錯誤的各種防御機制在一些情況下不可避免的失效所造成的結(jié)果。

現(xiàn)在的問題是，蛋白折疊錯誤的后果總是負面的，是否還是有其“光明面”？近年來的科學研究表明，蛋白形成淀粉樣聚合物不僅有致病作用，也有正面效果。在本文的第3部分中，將詳細介紹淀粉樣聚合物的“正面作用”，即它們的生理功能。

（待續(xù)）