周 潔, 趙麗娟, 陶凌云, 胡建華, 高 誠

(上海實驗動物研究中心, 上海 201203)

鼠痘病毒(ectromelia virus，ECTV)屬于痘病毒科正痘病毒屬，是引起小鼠鼠痘(ECT)病原體。1930年英國的Marchal在實驗鼠群中最早發(fā)現(xiàn)了患該病的小鼠足部缺失的特征明顯, 她將這種病稱為傳染性脫腳病(infectious ectromelia), 1947年Fenner將本病命名為鼠痘[1]。ECTV粒子呈磚形或卵圓形，大小為230 nm×170 nm, 由1個核心、2個側(cè)體和2層脂質(zhì)外膜組成, 是動物病毒中體積大、結(jié)構(gòu)最復雜的DNA病毒。該病毒基因組為雙股DNA，長度180～200 kb, 編碼200多種蛋白，基因組具有較長的約5 kb端重復序列(TTRS)，這一結(jié)構(gòu)可能與病毒繁殖方式有關(guān)[2]。ECT的臨床癥狀分為三種:急性感染的小鼠很快死亡; 慢性感染的小鼠最早出現(xiàn)的可見病變位置通常在面部、鼻、足或腹部，均伴有潰瘍性病灶，病鼠散在性連續(xù)性死亡，剖檢死亡小鼠可見肝臟、腎臟的出血性壞死; 脾臟腫大;淋巴結(jié)變大并時常伴有小腸出血。潛伏感染的小鼠不表現(xiàn)臨床癥狀, 潛在的病毒可在應激條件下爆發(fā)。目前ECTV廣泛存在于世界各國，嚴重影響實驗小鼠的繁育生產(chǎn)、動物實驗的順利進行以及科研數(shù)據(jù)的準確性和可重復性[3]。本文側(cè)重于對ECTV感染機制、免疫應答及診斷等方面進行闡述。

1 ECTV的遺傳抗性

早期研究[4]表明，ECT的抗病性取決于感染途徑、感染病毒的毒性和小鼠的基因型。近交系小鼠分為對ECTV感染抗病型和ECTV易感型。易感品系如BALB/c、A和DBA/2，不能控制病毒的復制和傳播，因而常發(fā)生不可控的肝壞死而最終死亡。另一方面，具有遺傳抗性的小鼠品系，如AKR、C57BL/6(B6)以及某些129品系小鼠的致病性和致死率較低。Orlowski等[5]研究認為樹突狀細胞(DCs)是將先天免疫系統(tǒng)與適應性免疫應答相連的效應細胞， BALB/c小鼠感染ECTV后病毒消除DCs以防止宿主反應，誘導免疫抑制并維持慢性感染有助于病毒的傳播。Dolega等[6]研究了BALB/c和C57BL/6小鼠感染ECTV-Mos后腹膜巨噬細胞中先天免疫基因的轉(zhuǎn)錄反應，揭示了基因表達的差異可能決定了BALB/c和C57BL/6小鼠對ECTV-Mos的致死感染的抵抗/易感性的差異。Cheng等[7]分別取感染ECTV后3～10 d的BALB/c和C57BL/6小鼠脾臟做基因芯片，分析二者的基因差異表達，結(jié)果顯示易感型BALB/c小鼠相對產(chǎn)生更多的差異表達基因，這些基因參與先天免疫、細胞凋亡、代謝和癌癥相關(guān)的通路，而C57BL/6抗病小鼠差異表達基因主要參與促分裂原活化蛋白激酶信號和白細胞跨內(nèi)皮遷移。

在ECT小鼠模型中, 普遍觀點認為近交系小鼠的遺傳抗性是由多種不相關(guān)聯(lián)的常染色體顯性基因控制。位于6號染色體上的鼠痘抗性基因1(Rmp-1)控制病毒在肝臟中的復制, 與自然殺傷細胞基因復合體(NKC)相關(guān)。鼠痘抗性基因2(Rmp-2)位點在2號染色體上，與補體C5基因相關(guān)。ECTV感染時，其對雌性小鼠的保護要強于雄性小鼠。C5基因缺陷小鼠，如DBA/2小鼠，感染時感染部位產(chǎn)生白細胞增多現(xiàn)象。而鼠痘抗性基因3(Rmp-3)連接在主要的組織相容性復合體(MHC)(H-2)上，通過CD8T細胞表達其功能，在感染后恢復中起到關(guān)鍵作用。鼠痘抗性基因4(Rmp-4)參與編碼性腺依賴功能基因，與選擇素基因復合體有關(guān)。ECTV天然抗病性機理在易感染品系感染后3 d開始出現(xiàn)臨床癥狀，在感染期間細胞內(nèi)serpinb9通過是維持成熟自然殺傷細胞和活化CD8T細胞與ECTV對抗[8-11]。

2 ECTV的免疫應答

免疫應答過程可以籠統(tǒng)分為固有免疫應答期和適應性免疫應答期兩個階段。在病毒入侵時，大多非特異性固有免疫應答在早期感染中被快速激發(fā)以保護宿主, 阻止感染進一步發(fā)生，同時等待特異性抗原應激緩慢的產(chǎn)生。ECTV的免疫和恢復很大程度上同時依賴于各種不同來源的固有免疫應激和適應性免疫應答，包括自然殺傷細胞、CD4和CD8 T淋巴白細胞、巨噬細胞、氮氧化合物、輔助性T細胞1型和α、β、γ-干擾素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)的效應器功能[12]。有研究[13-15]表明, B 細胞和抗體在ECTV感染的控制和恢復中亦有關(guān)鍵性作用。

2.1 ECTV初期感染中抗體的作用

很長一段時期內(nèi)，研究者對痘病毒的應激反應研究的重點都在T細胞效應器功能的作用上，而忽略了B細胞的功能。早期研究ECTV感染的B6小鼠得出的結(jié)論認為B細胞和抗體的作用或許來自T細胞的調(diào)亡[13]。單克隆抗體修飾的CD8(+)細胞亞型在ECTV感染的B6小鼠中的調(diào)亡抵消了細胞毒性T細胞(CTL)的應激反應，使小鼠不能清除病毒，因而大部分小鼠被ECTV感染后10 d死亡。另一方面，CD4T細胞的調(diào)亡導致非最佳條件的CTL應激反應，造成對病毒的控制和抵抗變得很弱。CD4T細胞的重要作用是幫助CTL的應激反應功能，因此，缺乏CD4T細胞會造成CTL抗病毒應激減弱。CTL的應激反應即使在感染的最后階段仍能對病毒產(chǎn)生抵抗，但不足以清除病毒。類似反應也曾在缺乏MHC 2類分子的感染小鼠體內(nèi)觀察到，MHC 2類分子在感染后26 d仍能在主要器官呈現(xiàn)耐病毒能力，與缺乏CD8T細胞的感染后很快就死亡的動物不一樣的是，這些小鼠在感染后12～14 d長出表皮點狀潰瘍。小鼠無論是CD4T缺乏還是MHC 2類分子缺乏，都不能產(chǎn)生中和抗體,因此這些動物缺乏CD4T淋巴細胞與B細胞相互作用的能力[12]。Reynolds 等[16]的研究認為, 多數(shù)痘病毒都表達一個約分子量200 000的膜蛋白同系物，在ECTV病毒中稱作C15蛋白, 可調(diào)節(jié)感染ECTV小鼠的CD4+T和CD8+T細胞的免疫活性。將C15蛋白基因N-末端附近具有終止密碼子的突變病毒注射到BALB/c小鼠足墊中, 死亡率比對照病毒組降低，免疫組織化學分析試驗也證實在腹股溝淋巴結(jié)、脾臟和肝臟中突變體病毒數(shù)量較對照病毒少, 表明突變病毒擴散和復制減少。Szulc-D?browska等[17]研究了ECTV感染對小鼠骨髓來源(GM-BM)細胞，包括常規(guī)樹突狀細胞和巨噬細胞的影響，結(jié)果表明ECTV能夠在GM-BM細胞中復制并嚴重損害其先天適應性免疫功能，表現(xiàn)為細胞細胞的形態(tài)變化較大，在感染晚期細胞凋亡加劇。此外，細胞不能攝取、加工、處理抗原從而形成完全的炎癥反應。因此，GM-BM細胞無法在原發(fā)性混合白細胞反應(MLR)中刺激異源性CD4+T細胞增殖。也就是說ECTV誘導GM-BM使其產(chǎn)生功能性免疫機制麻痹，從而影響其啟動下游的T細胞的激活能力。

2.2 ECTV二級感染中抗體的作用

研究[18]表明缺乏胸苷激酶的無毒性ECTV病毒株的復制比野生型毒株效率低，能引起細胞修飾和抗體應激，但在感染后4周動物體內(nèi)就無法再檢測到病毒。而正常的易感近交系小鼠品系，例如BALB/c，如果一開始接種無毒性毒株，那在感染野生型ECTV后能引發(fā)大量針對ECTV的免疫應激反應并最終清除病毒。

MHC、CD40和μMT基因敲除(MHC II, CD40和μMT)的小鼠, 一般對野生型ECTV易感, 但感染無毒性ECTV毒株后可完全恢復。但是當這些小鼠經(jīng)過二級野生ECTV感染時，就失去了產(chǎn)生大量中性抗體應激反應的能力，機體控制病毒的能力變?nèi)鯊亩赘猩踔林滤溃c未進行無毒性毒株感染實驗的動物類似。這表明B細胞的存在、CD4T細胞協(xié)同B細胞的相互作用以及后續(xù)抗體的產(chǎn)生, 是ECTV初期和二級感染中恢復的重要因素[17]。在痘病毒感染引起應激反應時, 一系列免疫因素, 包括CD4T和CD8T 淋巴細胞, IFN-α、IFN-β、IFN-γ和中性抗體都具有重要作用。不同的是, 二級感染的有效應激很大程度上取決于B細胞的應激和特異性病毒抗體[19]。在ECTV研究[20]中發(fā)現(xiàn)IFN在宿主應激反應中具有重要作用, ECTV作為一種小鼠易感病原體能和宿主共同進化, 它能編碼IFN分泌型受體的同源染色體，這并不是ECTV的獨有特征, 其它痘病毒也能編碼和調(diào)整宿主IFN受體的信號表達途徑。

3 病毒感染的致病機理

以往認為ECTV可以通過皮膚上的傷口或者污染物直接在動物之間傳播，例如鼠籠的污染。研究[21]表明ECTV最常通過鼠足墊的傳播而引起感染，病毒在動物感染部位表皮復制和釋放病毒性傳代物質(zhì)直至傳播至淋巴結(jié)、血液和其它器官。

當通過皮下途徑感染時，ECTV在感染位點復制，然后擴散至淋巴結(jié)病毒繼續(xù)復制。病毒侵入血液后引發(fā)一級病毒血癥使病毒進入脾臟和肝臟，在這些部位壞死細胞釋放更多病毒再進入血液引發(fā)二級病毒血癥，二級病毒血癥是導致皮膚出現(xiàn)點狀潰瘍的因素。這些潰瘍與人類感染天花時的臁瘡表現(xiàn)類似，其繼續(xù)作為感染源在表皮感染，也是作為傳播疾病的重要途徑。小鼠易感品系的死因通常是由于肝壞死，常常出現(xiàn)在感染后8～10 d，與小鼠體內(nèi)最高病毒滴度產(chǎn)生的時間相一致。

4 鼠痘的檢測和防控

抗體檢測方法有血凝抑制試驗(HAI)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫熒光試驗(IFA)和免疫酶試驗(IEA)等。1980年代開展實驗動物質(zhì)量檢測的初期, 國內(nèi)普遍采用HAI方法, 該方法對為預防ECT而接種牛痘苗的小鼠血清不呈現(xiàn)陽性反應，但HAI法存在假陰性, 現(xiàn)已不采用。1990年代以后，IFA、IEA 和ELISA等開始應用于常規(guī)檢測, 中華人民共和國國家標準實驗動物ECTV檢測方法“GB/T 14926.2001-20”規(guī)定了ECTV檢測方法，其中有“GB/T 14926.2001-50 酶聯(lián)免疫吸附試驗、GB/T 14926.2001-51 免疫酶試驗、GB/T 14926.2001-52 免疫熒光試驗、GB/T 14926.2001-55 免疫組織化學法”。其中各檢測機構(gòu)普遍采用間接ELISA方法，IFA可以檢出早期的抗體水平，也是目前較為常用的抗體檢測方法。對ECTV抗原檢測的傳統(tǒng)方法是采用病理切片，顯微鏡下觀察可見的典型痘病毒顆粒和痘病毒包涵體。另外, 把病毒分離接種于雞胚絨毛尿囊腔傳代后應產(chǎn)生融合性病灶，將其磨碎可產(chǎn)生特征性血球凝聚反應。潛伏感染的小鼠不易檢出抗體, 通常建議采用免疫酶組織化學法(HI)或PCR方法進行檢測。PCR技術(shù)檢測ECT病毒在國內(nèi)的報道首先出現(xiàn)于1998年[22], 可檢出0.1 pg的ECT病毒基因。2016年Wang等[23]建立了一種基于原位雜交的量子點熒光檢測方法, 使用biotin-dUTP替代dTTP，在聚合酶鏈反應期間將生物素摻入DNA探針中用于檢測ECTV基因組DNA。

目前尚無治療ECT有效方法，對于ECT,關(guān)鍵在于預防，而預防ECT最重要的是環(huán)境設(shè)施建設(shè)和管理的加強。建立嚴格的飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生防疫制度，SPF級環(huán)境設(shè)施的規(guī)范運行是目前控制ECT流行最有效途徑。對于有ECT爆發(fā)的鼠群應采取全群淘汰原則，疑似病例的發(fā)現(xiàn)應及時上報并診斷以采取防控措施。ECT的爆發(fā)嚴重影響實驗動物生產(chǎn)、干擾動物實驗結(jié)果。無可見臨床癥狀的潛伏期感染小鼠則是鼠群的一項巨大隱患，因此加強ECT病毒的檢測必不可少。國外最新研究[24]表明，利用痘病毒種屬間基因高同源性的特點，用多價天花病毒DNA疫苗免疫小鼠，再用缺失6個靶向基因的重組痘苗病毒進行加強免疫，可以保護小鼠免受150 LD50劑量的ECTV攻擊。

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