張紅楠，張旭輝，吳頔*，李勇*

(1.西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶400715；2.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶400715)

由核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)引起的菌核病可侵害多種植物，是油菜(Brassicacampestris)植株最為嚴(yán)重的病害之一[1-3]。該病害在我國(guó)各油菜產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，常年發(fā)病率在10%～40%之間，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)70%，極大地影響油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展帶來了巨大障礙。由于目前尚無理想的商品化抗病品種[3,5]，農(nóng)業(yè)上對(duì)油菜菌核病的防治主要為化學(xué)農(nóng)藥防治[6]。秦虎強(qiáng)等[7]研究發(fā)現(xiàn)腐霉利、多菌靈、甲基托布津和戊唑醇等4種農(nóng)藥對(duì)油菜菌核病菌具有一定的防治效果，其中50%多菌靈和80%甲基托布津的田間防效在76%左右。但是長(zhǎng)期使用殺菌劑很容易產(chǎn)生抗藥性，且不同地區(qū)的核盤菌抗性水平存有差異，同時(shí)藥物殘留和環(huán)境污染等問題已不符合農(nóng)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的要求[8]。輪作和土壤消毒等農(nóng)藝措施雖有一定防治效果，但是由于油菜核盤菌寄主范圍廣，菌核在土壤中存活周期較長(zhǎng)，使得防治不徹底；此外，輪作和土壤消毒的頻率較高和勞動(dòng)力要求較大，難以適應(yīng)中國(guó)集約化農(nóng)業(yè)種植模式的要求[9]。生物防治因其高效持久、環(huán)境友好和無藥物殘留等特點(diǎn)已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外防治油菜菌核病的研究熱點(diǎn)，并將逐漸成為植物病害防治的主流方向[10-11]。目前，已報(bào)道至少30種以上生防微生物對(duì)油菜菌核病具有防治效果，其中主要有芽孢桿菌(Bacillusspp.)[12]、假單胞菌(Pseudomonasspp.)和成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)[13]、放線菌(Actinomycetesspp.)[14]、木霉菌(Trichodermaspp.)[15]、盾殼霉(Coniothyriumminitans)[16]以及白僵菌(Beauveriabassiana)[17]等。

很多大型真菌的子實(shí)體從來不被病菌或昆蟲所侵襲[18]，而且受傷后的子實(shí)體能產(chǎn)生大量具有抗菌、殺蟲等效果的活性代謝產(chǎn)物[19]，因此可作為生物防治病害的重要資源。煙管菌(Bjerkanderaadusta)為木腐真菌，有研究發(fā)現(xiàn)，煙管菌能夠有效地防治褐腐病在櫟樹(Quercusrobur)上發(fā)生[20]。Bak等[21]分離到1株煙管菌菌株，研究表明該菌株具有抑菌防病作用，能夠有效防治歐美黑楊(Populuseuramericana)干腐病。國(guó)內(nèi)則僅有汪華等[22]報(bào)道了煙管菌對(duì)紋枯病菌(Thanatephoruscucumeris)、黃萎病菌(Verticilliumdahliae)、青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)等具有很好的防治效果。本課題組分離篩選獲得1株對(duì)西瓜蔓枯病菌(Didymellabryoniae)具有明顯拮抗作用的煙管菌[23]，豐富了其生防作用研究。但目前尚無煙管菌對(duì)油菜核盤菌抑制作用的研究報(bào)道，此外，煙管菌最適液體培養(yǎng)條件及實(shí)際防病效果等均未見研究。本研究利用前期分離獲得具有生防作用的煙管菌(B.adusta)為出發(fā)菌株，研究活體菌株及其代謝液對(duì)油菜核盤菌的防治效果，并在掃描電鏡下觀察其對(duì)油菜核盤菌的重寄生作用，進(jìn)而通過溫室盆栽試驗(yàn)檢測(cè)其實(shí)際防病效果，為油菜菌核病生物防治提供又一理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1生防真菌 本課題組于2015年7月在重慶北碚“國(guó)家紫色土肥力與肥料效益監(jiān)測(cè)基地”(E 106°24′33″，N 29°48′36″)以五點(diǎn)取樣法采集5～20 cm土層的土樣，經(jīng)分離篩選得到一株拮抗菌株，將其鑒定為煙管菌，命名為煙管菌M-1，其基因登錄號(hào)為KX377676[23]。

1.1.2病原真菌 油菜核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)由西南大學(xué)植物生態(tài)病理研究所惠贈(zèng)。

1.1.3培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1000 mL，pH 自然；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL，pH自然；液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，MgSO4·7H2O 0.1%，NH4Cl 1.0%， CaCl20.1%，KH2PO40.2%，pH自然；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，NH4Cl 1.0%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，CaCl20.1%，瓊脂1.5%～2.0%，pH自然。

1.1.4其他材料 油菜種子品種為德雜油9號(hào)采購自四川綿陽特研種業(yè)有限公司；50%多菌靈可濕粉劑購于威海韓孚生化藥業(yè)有限公司；70%甲基托布津可濕粉劑購于陜西美邦農(nóng)藥有限公司。用無菌水將兩種農(nóng)藥粉劑分別配制為0.4 mg·mL-1和80 μg·mL-1的液體藥劑，4 ℃保存?zhèn)溆?；植物栽培土為西南大學(xué)二號(hào)試驗(yàn)田紫色土，將其過2 mm篩后高壓蒸汽滅菌2 h。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌株M-1抑菌效果測(cè)定 通過菌餅對(duì)峙抑菌試驗(yàn)[24]測(cè)定菌株M-1活體菌對(duì)油菜核盤菌的體外抑菌效果。在PDA的平板上相距3 cm的兩點(diǎn)分別接種直徑5 mm的菌株M-1菌餅和油菜核盤菌菌餅，構(gòu)成兩點(diǎn)對(duì)峙，以分別加入3 mL 0.4 mg·mL-1的多菌靈和甲基托布津的平板為農(nóng)藥處理，以只接種油菜核盤菌的平板為對(duì)照組，于28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，十字交叉法[23]測(cè)量平板中油菜核盤菌菌落相對(duì)方向的菌落半徑，計(jì)算菌株M-1對(duì)油菜核盤菌的抑菌率。每個(gè)處理均設(shè)3次重復(fù)。

抑菌率= (對(duì)照菌落半徑-處理菌落半徑)/對(duì)照菌落半徑×100%

再通過液體培養(yǎng)液抑菌試驗(yàn)[25]測(cè)定菌株M-1無菌濾液對(duì)油菜核盤菌的抑菌效果。使用直徑5 mm的無菌打孔器打取M-1菌株菌餅5塊，接種在盛有100 mL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的無菌三角瓶中，在28 ℃、150 r·min-1條件下，震蕩培養(yǎng)5 d，用0.22 μm無菌濾器過濾其代謝液至10 mL離心管中，取3 mL無菌濾液與15 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合均勻，冷卻后再將油菜核盤菌菌餅接種到此培養(yǎng)基上，以不接拮抗菌菌株M-1液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的無菌濾液作為空白對(duì)照，以分別加入3 mL 0.4 mg·mL-1的多菌靈和甲基托布津作為農(nóng)藥對(duì)照。28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，十字交叉法[23]測(cè)量油菜核盤菌菌落直徑和其對(duì)照平板上的菌落直徑，計(jì)算拮抗菌菌株M-1無菌濾液對(duì)油菜核盤菌的抑菌率，每個(gè)組合3次重復(fù)。

抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%

1.2.2菌株M-1重寄生作用觀察 在PDA平板中央接種5 mm的油菜核盤菌菌餅，在距其3 cm的上下左右各接種同樣大小的菌株M-1菌餅，于28 ℃暗處恒溫培養(yǎng)90 h后觀察拮抗效果，以單接病原真菌的培養(yǎng)皿為對(duì)照組。再按1.2.1菌餅對(duì)峙抑菌試驗(yàn)的操作得到對(duì)峙平板，并在兩者之間平鋪一塊無菌錫箔紙至菌絲接觸，參考Shao等[26]的方法制備樣品，進(jìn)行顯微觀察和掃描電鏡觀察，揭示菌株M-1的重寄生作用。

1.2.3菌株M-1液體培養(yǎng)液熱穩(wěn)定性檢測(cè) 按照1.2.1液體培養(yǎng)液抑菌試驗(yàn)的方法得到菌株M-1無菌濾液，于40、60、80和100 ℃水浴處理30 min，以與室溫相近的水浴溫度處理為對(duì)照，隨后操作按照1.2.1的相關(guān)方法進(jìn)行，計(jì)算不同溫度水浴處理后菌株M-1液體培養(yǎng)液對(duì)油菜核盤菌的抑菌率，每個(gè)處理均設(shè)3次重復(fù)。

1.2.4菌株M-1液體培養(yǎng)條件選擇 通過單因素試驗(yàn)確定菌株M-1液體培養(yǎng)條件。其液體培養(yǎng)的碳源在乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖和蔗糖中選擇；在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，其氮源在硝酸銨、氯化銨、蛋白胨、硝酸鉀、酵母膏和牛肉膏中選擇，無氮源的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為空白對(duì)照；在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，調(diào)節(jié)其液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的C/N為1.2∶1、3.6∶1、4.8∶1、6.0∶1、7.2∶1、8.4∶1、12.0∶1和18.0∶1；在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，碳源用量分別以5、10、15、20和25 g·L-1添加；在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)節(jié)為3.0、5.0、7.0和9.0，從而確定菌株M-1液體培養(yǎng)最適的pH；在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，在20、25、30、35和40 ℃的溫度下進(jìn)行液體培養(yǎng)，150 r·min-1培養(yǎng)5 d；在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，在250 mL三角瓶中按照15%、30%、40%、45%、50%、60%和75%(V/V)的裝瓶量進(jìn)行液體培養(yǎng)， 150 r·min-1培養(yǎng)5 d；在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，于100、140、180和220 r·min-1的條件下?lián)u床培養(yǎng)5 d；在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，搖床震蕩培養(yǎng)5、10、15、20、25和30 d后檢測(cè)其抑菌率，其他操作按1.2.1中的相關(guān)方法進(jìn)行，并計(jì)算不同條件下菌株M-1對(duì)油菜核盤菌的抑菌率。每組處理3次重復(fù)，確定液體培養(yǎng)最佳的碳源、氮源、C/N、碳源用量、pH、溫度、裝瓶量、轉(zhuǎn)速和液體培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.5響應(yīng)曲面法優(yōu)化液體培養(yǎng)條件 在確定最佳液體培養(yǎng)條件基礎(chǔ)上，再根據(jù)響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)原理及方法[27]，進(jìn)行6因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，每個(gè)因素取低、中、高3個(gè)水平，分別記做-1、0和+1，為避免掩蓋其他因素的重要性，故某個(gè)因素高低水平的差值不能太大，因此，本試驗(yàn)設(shè)定高水平為低水平的1.4～1.8倍。以試驗(yàn)因子為自變量，以菌株M-1培養(yǎng)液對(duì)油菜核盤菌的抑菌率為響應(yīng)值，探究各因素對(duì)抑菌率的影響，確定其液體培養(yǎng)條件的最佳組合。

1.2.6溫室盆栽試驗(yàn) 盆栽試驗(yàn)于2016年3月至7月在西南大學(xué)1號(hào)溫室進(jìn)行，溫度為28～40 ℃，相對(duì)濕度為45%～70%。將剛發(fā)芽的油菜種子移栽至盛有2 kg無菌土的花盆(Φ19 cm×13 cm)中，緩苗20 d，繼續(xù)管理使其正常生長(zhǎng)。最適液體培養(yǎng)條件下培養(yǎng)得到菌株M-1菌液后，采用牙簽接種法[28]在生長(zhǎng)一致的油菜植株第3、4片老葉及距離根部20 cm處的莖部分別進(jìn)行接菌處理，試驗(yàn)設(shè)計(jì)4組處理，CK水：無菌水處理；CK?。河筒撕吮P菌處理；CT1：同時(shí)接種油菜核盤菌和菌株M-1的處理；CT2：接種油菜核盤菌并噴施10 mL 80 μg·mL-1多菌靈。每個(gè)處理組15株，各3次重復(fù)。溫室生長(zhǎng)兩周后根據(jù)Smith 等[29]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及計(jì)算方法統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)及拮抗菌的防病效果。0級(jí)：莖葉處均無病斑或葉片發(fā)病但病葉小于1%；1級(jí)：莖或者葉片出現(xiàn)小塊病斑，病葉在1%～25%；2級(jí)：莖或者葉片有大塊病斑，病葉在26%～50%；3級(jí)：莖或者葉片有大量病斑，葉片枯萎卷曲，病葉在51%～75%；4級(jí)：植株出現(xiàn)大量病斑，病葉在76%～90%；5級(jí)：病葉占到90%以上或者整株病死。

病情指數(shù)=∑(各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)級(jí)數(shù))/(調(diào)查植株總數(shù)×最高級(jí)數(shù))×100

防病效果=(CK病病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/CK病病情指數(shù)×100%

收獲油菜植株并測(cè)定每株葉片數(shù)、株高、根長(zhǎng)、莖圍、濕重、烘干后的干重。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用IBM SPSS Statistics 21軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)及分析；應(yīng)用Microsoft Excel 2007進(jìn)行圖表制作；借助 Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面條件優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株M-1抑菌效果

以菌餅對(duì)峙抑菌試驗(yàn)測(cè)定菌株M-1體外抑菌效果，表1顯示，菌株M-1對(duì)油菜核盤菌的抑菌率達(dá)到67.9%，分別是多菌靈處理和甲基托布津處理的3.0和2.2倍，均達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)。而在液體培養(yǎng)抑菌試驗(yàn)中，菌株M-1無菌濾液的抑菌活性同樣高于農(nóng)藥處理，其對(duì)油菜核盤菌的抑菌率達(dá)到51.8%，分別是多菌靈處理和甲基托布津處理的1.3和2.2倍，不同處理間均達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)。

2.2 菌株M-1重寄生作用

如圖1所示，恒溫培養(yǎng)90 h后，單接油菜核盤菌的菌落長(zhǎng)滿整個(gè)平板(圖1A)，而同時(shí)接種菌株M-1的病原真菌生長(zhǎng)明顯受到抑制， 其菌落四周均出現(xiàn)抑菌帶(圖1B)。顯微觀察發(fā)現(xiàn)， 在菌落交界處兩者的菌絲形態(tài)均發(fā)生變化，菌株M-1菌絲由非拮抗區(qū)的疏松、分枝(圖1C)變?yōu)檗卓箙^(qū)的濃密、筆直、無分枝(圖1D)，而油菜核盤菌的菌絲由非拮抗區(qū)的細(xì)且多分枝(圖1E)變?yōu)榇智疑俜种?圖1F)，說明兩者已進(jìn)入拮抗互作期。在掃描電鏡下則清晰地觀察到菌株M-1菌絲直接穿插、刺透油菜核盤菌菌絲，使后者菌絲膨大、變形甚至破裂，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的重寄生作用(圖1G，H)。

2.3 菌株M-1液體培養(yǎng)液熱穩(wěn)定性

由圖2可見，M-1菌株對(duì)油菜核盤菌抑菌率最高的溫度處理為40 ℃，80 ℃處理后抑菌率在38.9%，而100 ℃處理后抑菌率仍達(dá)到35.4%， 60、80和100 ℃處理間無顯著差異(P>0.05)，并且其抑菌率均在37%左右，說明菌株M-1液體培養(yǎng)液具有熱穩(wěn)定性。

表1 各處理對(duì)油菜核盤菌的抑菌率Table 1 Inhibitory rates of different treatment against S. sclerotiorum (%)

注：均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3). 不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05), 0.4 mg·mL-1多菌靈和甲基托布津?yàn)檗r(nóng)藥對(duì)照, 下同。

Note: mean±SD (n=3). The different lowercase letters represent the existence of significant differences atP<0.05, and 0.4 mg·mL-1carbendazim and thiophanate methyl were as control group, the same below.

圖1 菌株M-1對(duì)油菜核盤菌的拮抗作用及重寄生作用 Fig.1 The antagonism and mycoparasitism of B. adusta M-1 against S. sclerotiorum A: 油菜核盤菌; B: 被抑制的油菜核盤菌; C: 生防菌非拮抗區(qū)菌絲; D: 生防菌拮抗區(qū)菌絲; E: 病原菌非拮抗區(qū)菌絲; F: 病原菌拮抗區(qū)菌絲; G，H: 煙管菌M-1對(duì)油菜核盤菌的重寄生作用。M-1為煙管菌菌絲，S為油菜核盤菌菌絲。 A: S. sclerotiorum; B: Inhibited S. sclerotiorum; C: B. adusta mycelium not in antagonistic region; D: B. adusta mycelium in antagonistic region; E: S. sclerotiorum mycelium not in antagonistic region; F: S. sclerotiorum mycelium in antagonistic region; G,H: The mycoparasitism of B. adusta M-1 against S. sclerotiorum. M-1 representative B. adusta strain, S representative S. sclerotiorum strain.

2.4 菌株M-1液體培養(yǎng)條件選擇

通過單因素試驗(yàn)選擇最適液體培養(yǎng)條件，如圖3所示，不同條件對(duì)菌株培養(yǎng)液的抑菌率具有不同影響。菌株M-1對(duì)油菜核盤菌抑菌率最高時(shí)的液體培養(yǎng)碳源為麥芽糖(圖3A)，最適氮源為硝酸銨(圖3B)，對(duì)油菜核盤菌的抑菌率分別達(dá)到68.8%和66.2%，顯著高于其他處理(P<0.05)。隨著C/N升高，其抑菌率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，C/N為7.2∶1時(shí)抑菌率達(dá)到最大的100%(圖3C)。20 g·L-1的碳源用量抑菌率達(dá)到最高，可確定其為最佳用量(圖3D)。培養(yǎng)液酸堿性對(duì)其抑菌率有較大影響，酸性環(huán)境下抑菌率要明顯高于中性和堿性，在pH為5.0時(shí)抑菌率最高(圖3E)。培養(yǎng)溫度對(duì)抑菌率的影響也表現(xiàn)出先升高后降低的規(guī)律(圖3F)，在25 ℃時(shí)抑菌率達(dá)到最高的53.8%，由此可確定25 ℃為最適液體培養(yǎng)溫度。裝瓶量為30%(v/v)時(shí)抑菌效果最好，50%裝瓶量的抑菌率最低，均與其他處理間達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)，確定30%為最佳裝瓶量(圖3G)。轉(zhuǎn)速在140 r·min-1(圖3H)、培養(yǎng)20 d(圖3I)時(shí)均達(dá)到最大抑菌率，分別為90%和77.8%。

圖2 不同溫度處理對(duì)菌株M-1液體培養(yǎng)液抑菌率的影響Fig.2 Effects of different temperature treatments on the inhibitory rate of fermentation broth 不同小寫字母表示差異顯著，下同。The different lowercase letters represent the existence of significant differences at P<0.05, the same below.

2.5 響應(yīng)曲面法優(yōu)化液體培養(yǎng)條件

根據(jù)單因素水平試驗(yàn)，進(jìn)行響應(yīng)曲面法的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。對(duì)油菜核盤菌抑菌率的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子與響應(yīng)值以及回歸方程的方差分析見表2和表3。

圖3 不同液體培養(yǎng)條件對(duì)菌株M-1代謝液抑菌率的影響Fig.3 Effect of fermentation broth in different fermentation conditions on the inhibitory rate

代碼Name試驗(yàn)因子Factor編碼值Codevalue-10+1代碼Name試驗(yàn)因子Factor編碼值Codevalue-10+1AC/N6．07．28．4D時(shí)間Time(d)152025BpH4．05．06．0E轉(zhuǎn)速Rotationspeed(r·min-1)140180220C裝瓶量Bottlingquantity(%)303540F溫度Temperature(℃)253035

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸方程的方差分析Table 3 ANOVA analysis of regression equation of test design

借助 Design Expert 8.0.6軟件對(duì)以上數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到抑菌率Y對(duì)編碼自變量的二次回歸多項(xiàng)方程為：Y=79.10+5.55×A-1.27×B-0.75×C+2.22×D+0.65×E+2.66×F-0.90×A×B-7.80×A×C+0.87×A×D-5.24×A×E+1.08×A×F+6.26×B×C-8.52×B×D+1.61×B×E-2.08×B×F-0.59×C×D-5.69×C×E-7.19×C×F+5.66×D×E+4.91×D×F+0.27×E×F-19.28×A2-13.11×B2-9.23×C2-9.29×D2-23.40×E2-12.69×F2。

圖4 響應(yīng)曲面中兩兩因子間對(duì)響應(yīng)值的影響Fig.4 The influence between any two factors on the response value in the surface response

以F-檢驗(yàn)判斷各項(xiàng)變量對(duì)響應(yīng)值的顯著性(表3)可知，擬合的二階模型的F值為3.81，概率P (Prob>F)為 0.0005，小于0.01，說明模擬達(dá)到顯著水平。方差分析發(fā)現(xiàn)其二次項(xiàng)對(duì)抑菌率的影響有顯著差異，說明各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。因此可以用該模型對(duì)培養(yǎng)液抑菌率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，也能夠利用該回歸方程確定最適液體培養(yǎng)條件。

根據(jù)回歸方程得出不同因子的響應(yīng)曲面分析圖，如圖4顯示，固定其中4個(gè)因子而另2個(gè)變量因子可以三維模型展現(xiàn)其與響應(yīng)值(抑菌率)的關(guān)系，響應(yīng)面開口向下，存在最大值。由Design Expert 8.0.6軟件預(yù)測(cè)出最大值點(diǎn)Y=80.9%，此時(shí)對(duì)應(yīng)的最佳條件為：C/N為7.49，pH為4.71，裝瓶量為33.13%，時(shí)間為21.79 d，轉(zhuǎn)速為180 r·min-1，溫度為31.56 ℃，但考慮到實(shí)際操作，可確定菌株M-1對(duì)油菜核盤菌抑制效果最好的液體培養(yǎng)條件為：C/N為7.5，pH為4.7，裝瓶量為33%，時(shí)間為22 d，轉(zhuǎn)速為180 r·min-1，溫度為32 ℃。培養(yǎng)條件優(yōu)化后，對(duì)油菜核盤菌的抑菌率高于未經(jīng)優(yōu)化的51.8%，抑菌效果大幅增加。

2.6 溫室盆栽試驗(yàn)

由表4可見，各處理對(duì)油菜植株生長(zhǎng)情況均有不同。CK水葉片數(shù)與CT2相等，略高于CT1，但3個(gè)處理間均未達(dá)到顯著差異水平(P>0.05)，CK病葉片數(shù)最少，與其他處理間均有顯著差異(P<0.05)。CT1的株高、根長(zhǎng)、莖圍、濕重以及干重均高于CK病，僅根長(zhǎng)、濕重和干重高于CT2。對(duì)油菜植株的病情指數(shù)和防病效果進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，菌株M-1處理的病情指數(shù)顯著低于CK病和多菌靈處理(P<0.05)，而防病效果達(dá)到71.4%，高于多菌靈處理，對(duì)油菜核盤菌的防病效果好于農(nóng)藥處理，說明菌株M-1具有田間應(yīng)用潛力。

表4 盆栽試驗(yàn)中各處理對(duì)油菜生長(zhǎng)及防病效果影響Table 4 Effects of different treatments on rapeseed growth and disease control in pot experiment

CK水為無菌水處理；CK病為油菜核盤菌的處理；CT1為接種油菜核盤菌和菌株M-1的處理；CT2為接種油菜核盤菌并噴施10 mL 80 μg·mL-1多菌靈的處理。CK-water was treatment with aseptic water; CK-disease was treatment withS.sclerotiorum; CT1was treatment withS.sclerotiorumand strain M-1 simultaneously; CT2was treatment withS.sclerotiorumand 10 mL 80 μg·mL-1carbendazim simultaneously.

3 討論

利用生防菌進(jìn)行油菜菌核病的防治已有大量研究，但是煙管菌對(duì)油菜核盤菌的生防研究至今未見報(bào)道。本研究以所分離、鑒定的煙管菌為出發(fā)菌株，初次探究了其對(duì)油菜核盤菌的抑制效果，進(jìn)一步明確了其生防作用價(jià)值。結(jié)果表明，不論是活體菌株的體外抑菌還是菌株無菌濾液，對(duì)油菜核盤菌均有較好的抑制作用。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，在菌落交界處兩者的菌絲均發(fā)生變化，掃描電鏡下顯示菌株M-1菌絲直接穿插、刺透油菜核盤菌菌絲，使后者菌絲膨大、變形甚至破裂，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的重寄生作用，而在盆栽試驗(yàn)中的防病效果達(dá)到71.4%，明顯高于農(nóng)藥處理，充分說明菌株M-1對(duì)核盤菌具有較好的生防作用。與一些生防菌類似，煙管菌可通過與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、寄生于病原菌菌絲以及產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)等作用機(jī)制來抑制或殺死病原菌，達(dá)到防病效果[30]。此外，煙管菌為木腐真菌，其子實(shí)體能產(chǎn)生大量具有抗菌活性代謝產(chǎn)物[19]，這也可能會(huì)對(duì)油菜核盤菌的抑制效果起到重要作用。

生防菌寄生病原真菌的過程是通過產(chǎn)生吸器或者類似吸器的結(jié)構(gòu)直接穿透靶標(biāo)菌絲[31]，或者是通過分泌溶解性及次級(jí)代謝產(chǎn)物來識(shí)別、接觸并溶解病原真菌菌絲[32]。Ohberg等[33]發(fā)現(xiàn)盾殼霉能夠寄生核盤菌的菌絲和菌核，從而控制由核盤菌引起的作物菌核病。也有研究[34-35]表明，盾殼霉在重寄生過程中，菌絲頂端可以直接穿透并侵入核盤菌的細(xì)胞壁。韓立榮等[14]報(bào)道了放線菌11-3-1菌株能夠使油菜核盤菌的菌絲體發(fā)生畸形變化，菌絲腫脹、彎曲，菌絲體內(nèi)原生質(zhì)濃縮。本研究發(fā)現(xiàn)煙管菌M-1在生防作用中使油菜核盤菌菌絲形態(tài)發(fā)生變化，并可直接穿插、刺透油菜核盤菌菌絲，使后者菌絲膨大、變形甚至破裂，與前人研究基本相符。因此，可認(rèn)為重寄生作用是生防菌對(duì)油菜核盤菌生物防治的主要作用機(jī)制之一。

利用微生物抑制油菜核盤菌的生防研究取得了一定進(jìn)展，但是溫度等環(huán)境因子會(huì)嚴(yán)重影響其防治效果[36]。楊蕊等[16]研究發(fā)現(xiàn)盾殼霉 Chy-1在改良的查彼液體培養(yǎng)基(Modified Czapek-Dox，MCD)的培養(yǎng)濾液經(jīng)120 ℃處理后對(duì)核盤菌的抑菌活性有所下降，但其抑菌率仍達(dá)到49.5%，說明濾液中活性物質(zhì)具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。為確保煙管菌M-1在溫度較高的田間環(huán)境也能發(fā)揮生防作用，本研究檢測(cè)了其代謝液的熱穩(wěn)定性，結(jié)果表明，其代謝濾液經(jīng)80 ℃甚至100 ℃處理30 min后，抑菌率仍在35%以上，較好的熱穩(wěn)定性將有利于菌株在實(shí)際生產(chǎn)中有效防治油菜菌核病。

抗菌活性物質(zhì)通常作為生防菌發(fā)揮生物防治作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其種類和產(chǎn)量均能影響生防菌株的實(shí)際應(yīng)用效果。從盾殼霉培養(yǎng)濾液中鑒定出的內(nèi)酯類抗生素和絲氨酸蛋白酶對(duì)核盤菌具有很強(qiáng)的抑制作用[37-38]，而解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)產(chǎn)生的脂肽類代謝活性物質(zhì)對(duì)油菜核盤菌具有強(qiáng)烈的抑制作用[39]。木霉菌則能夠產(chǎn)生多種非揮發(fā)性代謝抑菌產(chǎn)物，諸如幾丁質(zhì)酶類、纖維素酶及木聚糖酶等蛋白酶類均參與核盤菌的生防作用[40]。本研究結(jié)果表明，菌株M-1無菌濾液對(duì)油菜核盤菌具有明顯的抑制作用，說明其代謝液中抑菌物質(zhì)的活性較高，但究竟是內(nèi)酯類抗生素、脂肽類、蛋白酶類或其他活性物質(zhì)在起抑菌作用尚不清楚，后續(xù)將針對(duì)其活性成分以及敏感性進(jìn)行深入研究。

響應(yīng)曲面法優(yōu)化可以在合理范圍內(nèi)減少試驗(yàn)次數(shù)，考察不同變量及其之間的交互作用對(duì)相應(yīng)值的影響，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物工程的條件優(yōu)化中。藍(lán)星杰[41]采用此方法優(yōu)化了生防菌株SC11發(fā)酵條件，提升了發(fā)酵液對(duì)核盤菌的抑制效果。本研究采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法對(duì)菌株M-1液體培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳條件組合：C/N為7.5，pH為4.7，裝瓶量為33%，時(shí)間為22 d，轉(zhuǎn)速為180 r·min-1，溫度為32 ℃，優(yōu)化后的抑菌率可以提升到80.9%。

本研究通過純天然、無害化處理的生物防治手段對(duì)油菜菌核病進(jìn)行了抑菌研究，其生防菌株完全來自自然生物，具有綠色、安全、無污染、無殘留等特點(diǎn)，且在盆栽試驗(yàn)中的防病效果顯著，但是，油菜植株-油菜核盤菌-煙管菌所構(gòu)成的生物體系在病害發(fā)生與防治的復(fù)雜過程中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究，以便能夠更好地開發(fā)利用該生防菌，從而最大效應(yīng)地發(fā)揮其生防作用潛力。

4 結(jié)論

煙管菌M-1菌株作為生防真菌對(duì)油菜核盤菌具有一定的抑制效果，并且對(duì)核盤菌具有明顯的重寄生作用，其無菌濾液具有熱穩(wěn)定性。通過單因素和響應(yīng)曲面法對(duì)其液體培養(yǎng)條件優(yōu)化后，確定了最佳條件組合，優(yōu)化后的抑菌率可大幅提升。溫室盆栽中對(duì)油菜菌核病的防病效果達(dá)到71.4%，高于多菌靈處理。因此，該菌株作為生防菌具有重要應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)前景。

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