陳祎， 宋婷玉， 李金海， 肖永樂， 曾光志， 萬小平，楊璐一， 方鵬飛*， 王澤洲， 高榮*

1. 四川大學生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，動物疾病防控和食品安全四川省重點實驗室，成都610065；2. 四川省華派生物制藥有限公司，成都610026； 3. 四川省動物疫病預防控制中心，成都610035)

細胞因子因其安全性和高效性而成為一種理想的免疫佐劑，例如γ-干擾素(IFN-γ)(Wangetal.，2013)、白細胞介素2(IL-2)(Yangetal.，2010)、白細胞介素4(IL-4)(Zhangetal.，2007)和白細胞介素6(IL-6)(Lietal.，2011)。IL-2、IL-4和IL-6在細胞和體液免疫反應中起重要作用。IL-2具有多種生物學功能，包括促進T細胞增殖和增強NK細胞的細胞毒性，刺激活化的B淋巴細胞增殖，并誘導免疫球蛋白分泌等(Collins & Oldham，1993)。IL-4可影響體液免疫和細胞免疫應答，如免疫球蛋白的產(chǎn)生、類別轉換和分泌(Pasquinietal.，1997)。IL-6具有促進白細胞介素基因表達、B細胞分化、T細胞活化的作用(Kishimoto，2010)。

豬IL-2或IL-6與CpG免疫刺激序列的混合基因能有效提高動物對病原菌的抵抗力(Yangetal.，2010；Huangetal.，2013)；此外，豬IL-4/6融合基因與單獨的IL-4和IL-6相比，能誘導機體產(chǎn)生更強的免疫應答；豬IL-4/6融合基因能加強大腸桿菌疫苗、豬肺炎支原體疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)疫苗對機體的體液和細胞免疫，提高接種動物的免疫保護性(Zhangetal.，2007；Zhangetal.，2012；Yangetal.，2013)；豬IL-2、IL-4、IL-6的融合基因(IL-4/6-2)相比于IL-4/6和IL-2在小鼠Musmusculus上可產(chǎn)生更強的免疫協(xié)同調節(jié)作用(楊璐一等，2014)。

因此，本實驗在前期研究的基礎上，為研制新型高性價比的PCV-2疫苗免疫調節(jié)劑，評估共表達IL-2和IL-4/6融合基因納米顆粒對仔豬生長和PCV-2免疫應答的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

質粒：真核表達載體VR1020-豬融合白細胞介素4/6-2(VRIL-4/6-2)，由本實驗室構建并保存；殼聚糖(CS)：15 kD，脫乙酰度95%以上，購自Sigma Aldrich；多聚磷酸鈉(TPP)：購自Sigma(USA)；鱟試劑：購自湛江A & C公司；疫苗：PCV-2滅活疫苗(ZJ/C株)(圓環(huán)康)和實驗動物：健康21日齡長白、約克夏和杜洛克雜交仔豬均由四川省華派生物制藥有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1VRIL-4/6-2真核表達質粒的大量制備及內毒素檢測參照《分子克隆指南 第三版》(Josephetal.，2002)制備質粒，溶解于TE緩沖液，質粒濃度和純度使用紫外分光光度計檢測；質粒內毒素含量用鱟試劑檢測。

1.2.2VRIL-4/6-2質粒殼聚糖納米顆粒的制備離子交聯(lián)法(Bodmeieretal.，1989)制備VRIL-4/6-2質粒殼聚糖納米顆粒。將殼聚糖溶解于1%的冰醋酸溶液(pH5.5)，配制為2.4 mg·mL-1的溶液；ddH2O配制10 mg·mL-1的磷酸三苯酯(TPP)溶液；以上溶液均用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。將VRIL-4/6-2質粒與適量TPP溶液混勻，55 ℃孵育20 min；殼聚糖與質粒質量比為30∶1，在50～55 ℃水浴磁力攪拌下將質粒與TPP的預混液緩慢滴加至殼聚糖溶液中，混合均勻，恒溫孵育10 min備用，記作VRIL-4/6-2-CS。用Zetasizer3000HS/IHPL粒度儀檢測納米顆粒粒徑和電位。

1.2.3動物實驗10頭21日齡長白、約克夏和杜洛克雜交仔豬，經(jīng)ELISA和熒光定量PCR(qPCR)檢測PCV-2、PRRS病毒、豬瘟病毒和支原體均為陰性。隨機分成實驗組和對照組，每組5頭。實驗組頸部肌肉注射2.5 mL VRIL-4/6-2-CS(0.5 mg·mL-1)，對照組注射相同劑量生理鹽水；2組均頸部肌肉注射2.5 mL PCV-2疫苗。豬免疫接種前記為第0天，接種后第7、14、28天定時采集前腔靜脈血用于檢測免疫反應。接種前及實驗結束第28天時分別測量2組仔豬的體質量，用于評價實驗質粒對仔豬生長的影響。

觀察組48例中，痊愈15例，顯效20例，有效10例，無效3例，總有效率為93.75%；對照組48例中，痊愈11例，顯效15例，有效12例，無效10例，總有效率為79.16%，觀察組明顯優(yōu)于對照組，兩組效果比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

1.2.4PCV-2特異性抗體的測定取500 μL抗凝血低速離心后收集血清，參照ELISA試劑盒說明書操作，在酶標儀上測定OD630值，檢測血清中PCV-Ab的含量，試劑盒購自武漢科前生物公司。

1.2.5IgG1和IgG2a的測定取500 μL抗凝血低速離心后收集血清，參照ELISA 試劑盒說明書操作，在酶標儀上測定OD450值，檢測血清中IgG1和IgG2a的含量，試劑盒購自成都敏鑫科生物科技公司。

1.2.6CD4+和CD8+T淋巴細胞的測定取100 μL新鮮抗凝血搖勻，加入2 μL anti-porcine CD3-SPRD、2 μL anti-porcine CD4-FITC、2 μL anti-porcine CD8-PE，震蕩混勻避光孵育30 min；加入600 μL紅細胞裂解液，避光裂解10 min，500 r·min-1離心5 min，去上清；加入1 mL 磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，輕輕懸浮細胞，500 r·min-1離心5 min，去上清；重復洗滌1次，細胞沉淀加入300 μL PBS混勻，懸浮細胞，上機檢測。

1.2.7熒光定量檢測基因表達水平100 μL抗凝血加入1 mL的RNAiso pius，充分裂解后提取細胞總RNA，用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for Qpcr (One-Step gDNA Removal)反轉錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)GenBank中的豬PPIA、TLR-2、TLR-7、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、STAT-1、STAT-2、STAT-3基因的cDNA序列，分別設計合成其特異性擴增引物(表1)。

以仔豬不同時期血液cDNA為模板，表1中設計的引物進行擴增。用Bio-Rad IQ5熒光定量PCR儀檢測不同基因相對表達的情況，15 μL體系，用SsoAdvanceTMUniversal SYBR Green Supermix進行熒光定量分析。擴增參數(shù)為：95 ℃ 預變性30 s；95 ℃變性 5 s，最佳退火溫度退火30 s，40個循環(huán)。熔解曲線參數(shù)：65～95 ℃，每6 s上升0.5 ℃。PPIA為內參基因，采用2-ΔΔCT法分析實時熒光PCR數(shù)據(jù)，比較同一目的基因不同時期的相對表達水平差異。

1.2.8數(shù)據(jù)分析以上各數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6中的雙因素方差分析和單因素方差分析進行差異比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

表1 熒光定量PCR特異性引物Table 1 The primers for qPCR

2 結果

2.1 仔豬體質量變化

實驗開始及結束時分別稱量每只仔豬的體質量，分別計算每組仔豬體質量的平均值和方差，仔豬體質量變化見表2。結果顯示，實驗組仔豬體質量增加顯著高于對照組(P<0.05)。

表2 實驗28天仔豬體質量變化Table 2 Body mass change of piglets during 28 days

注 Note：*P<0.05

2.2 仔豬血清中特異性抗體含量

在接種第7天后，實驗組和對照組中均可以檢測到PCV-2抗體，但是2組含量之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 仔豬血清中PCV-2抗體含量的變化Fig. 1 PCV-2 antibody titers in the serum of the experimental piglets

S/P=(S-N)/(P-N)=(樣品OD值-陰性對照OD值)/(陽性對照OD值-陰性對照OD值)， 當S/P≥0.16時， 認為PCV-2抗體檢測為陽性

S/P=(S-N)/(P-N)=(ODsample-ODnegative control)/(ODpositive control-ODnegative control)， titer of PCV-2 antibody was considered positive whenS/P≥0.16

2.3 仔豬血清中IgG1 和IgG2a 含量

實驗組仔豬血清中IgG1的含量顯著低于對照組(P<0.05)，而IgG2a的含量顯著高于對照組(P<0.05)(圖2)。

2.4 CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群

流式細胞術檢測仔豬血液中CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群的數(shù)量變化，實驗組仔豬血液中的CD4+T和CD8+T淋巴細胞的數(shù)量與對照組相比均顯著增加(P<0.05)(圖3)。

2.5 免疫相關基因表達量分析

2.5.1Toll-like受體基因表達定量分析實驗組TLR-2基因的表達水平只在免疫后第14天顯著高于對照組(P<0.05)，而實驗組TLR-7基因的表達水平在免疫后第28天顯著高于對照組(P<0.05)(圖4)。

圖2 仔豬血清中IgG1和IgG2a含量的變化Fig. 2 The change of the levels of IgG1 and IgG2a in the serum of piglets

圖3 仔豬血液中 CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)量的變化Fig. 3 CD4+ and CD8+ T cell numbers in the blood of experimental piglets

2.5.2細胞因子基因表達定量分析實驗組仔豬血液中IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α基因的表達水平在免疫后第28天均顯著高于對照組(P<0.05)，其中，IL-4和IL-6基因表達水平分別在第7天和第14天顯著高于對照組(P<0.05)(圖5)。

2.5.3免疫信號傳導分子基因表達定量分析STAT-1基因表達水平在免疫后第7～14天均顯著高于對照組(P<0.05)，STAT-2基因表達水平在免疫后第14～28天顯著高于對照組(P<0.05)，STAT-3基因表達水平在免疫后第7、28天顯著高于對照組(P<0.05)(圖6)。

3 討論

細胞因子是調節(jié)動物免疫功能的關鍵分子。許多細胞因子被證實作為佐劑對體液或細胞免疫有增強作用(Pasquinietal.，1997；Kayamuroetal.，2010)。IL-2不僅支持T細胞和NK細胞的活化和增殖，還可以刺激和活化B淋巴細胞增殖和誘導免疫球蛋白分泌(Smith，1988；Collins & Oldham，1993)。IL-4可促進體液免疫，增加特異性和非特異性殺傷功能(Erbetal.，1997；Paul，2015)。IL-6可調節(jié)B細胞活化、抗體產(chǎn)生和Th1型免疫反應(Paul & Seder，1994；Kishimoto，2006)。有研究表明，豬IL-4/6、IL-2和IL-4/6-2融合基因均可安全增強動物系統(tǒng)和全面的免疫(Yangetal.，2010，2013；楊璐一等，2014)。基于以前的研究，本研究第一次將豬IL-4/6-2融合基因應用到豬上，來加強對PCV-2疫苗的免疫效果。

圖4 仔豬TLR基因表達水平的變化Fig. 4 The change of expression levels of TLR gene in the blood of experimental piglets

圖5 仔豬細胞因子基因表達水平的變化Fig. 5 The change of cytokine gene expression in the blood of experimental piglets

圖6 仔豬免疫信號傳導分子基因表達水平的變化Fig. 6 The change of the immune signal transduction molecules related genes in the blood of experimental piglets

本實驗用殼聚糖將重組質粒VRIL-4/6-2包裹，制備殼聚糖納米顆粒，與PCV-2疫苗同時對實驗仔豬進行肌肉注射免疫接種。實驗所用重組質粒通過2A短肽連接3種白細胞介素基因，構建共表達質粒。2A短肽具有的自剪切機制使連接前后的基因表達量相同(de Felipe & Ryan，2004；Szymczak & Vignali，2005)。裸露的基因不穩(wěn)定且半衰期短，轉染效率低；而殼聚糖包裹質粒可形成小的帶正電荷的納米顆粒，與裸露的質粒相比，它可以更有效地攜帶目的基因進入細胞，還可以抑制其在生物體內降解，被證實是一種有潛力的緩釋材料，并且還具有生物相容性(Chewetal.，2003；Cui & Mumper，2003)，因此，殼聚糖作為基因載體的研究發(fā)展迅速(Buschmannetal.，2013；Fernándezetal.，2016)。Huang等(2005)通過熒光標記研究殼聚糖-DNA復合粒子進入細胞的過程，證實了殼聚糖-DNA復合粒子可以被細胞內吞，繼而進行后續(xù)基因轉染。之前的研究也表明，殼聚糖納米粒子在動物身上用于基因傳遞幾乎沒有毒性和影響(Yangetal.，2010；Zhangetal.，2012)，并且空白載體質粒組與空白組沒有差異(Yangetal.，2010)。本次實驗由于陰性動物難于篩選獲得，數(shù)量有限，并未進行空白載體質粒組的實驗。

在實驗期間，實驗組和對照組仔豬注射局部均未出現(xiàn)病變、損傷或其他系統(tǒng)性癥狀。實驗開始和結束時分別記錄了每只仔豬的體質量，結果顯示，實驗組仔豬的生長速率顯著高于對照組。有研究顯示，IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α等細胞因子可在豬小腸中持續(xù)表達，并且細胞因子除了直接的免疫調節(jié)作用，還可影響上皮細胞的生長、內環(huán)境穩(wěn)態(tài)和免疫細胞的運輸(Oswald，2006；Devriendtetal.，2010)。推測VRIL-4/6-2質粒對調節(jié)仔豬內分泌、促進物質代謝有積極作用。

PCV-2特異性抗體和PCV-2中和抗體是體液免疫反應的重要檢測指標(Meertsetal.，2006；Fortetal.，2007)。研究結果表明，實驗組和對照組仔豬血清中PCV-2抗體的含量差異無統(tǒng)計學意義，且實驗組仔豬血清中IgG1的含量顯著低于對照組，這表明IL-4/6-2可能沒有明顯增強仔豬對PCV-2疫苗的體液免疫。此外，有研究顯示，誘導細胞免疫對于PCV-2的防控很有必要(Fortetal.，2009)。本研究結果表明，實驗組的CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)量顯著高于對照組，并且實驗組的IL-2、TNF-α基因表達水平在第28天顯著高于對照組。IL-2、IFN-γ和TNF-α均由Th1細胞產(chǎn)生，Th1細胞可誘導巨噬細胞活化、遲發(fā)性超敏反應和IgG2a的產(chǎn)生(Mosmann & Coffman，1989；Abbasetal.，1996)。同時，本次實驗發(fā)現(xiàn)，接種質粒的實驗組比對照組產(chǎn)生了更多的IgG2a抗體，表明實驗組仔豬產(chǎn)生了更強的Th1型免疫應答，相比對照組，VRIL-4/6-2-CS提高了仔豬對PCV-2疫苗的細胞免疫應答。

另外，實驗組仔豬血液中IL-4、IL-6、TLR-2、TLR-7、STAT-1、STAT-2、STAT-3基因的表達水平在不同時間段內也顯著高于對照組。TLRs是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，Toll-like受體在先天免疫中識別不同病原菌的保守分子模式，并參與對病原體的特異性體液和細胞免疫反應的激活(Kawai & Akira，2010)。STAT-1、STAT-2參與IFNs應答反應，并在干擾素抗病毒應答調節(jié)中起重要作用(Mitchell & John，2005；Steen & Gamero，2013)；STAT-3可由多種細胞因子激活，例如IL-6、IL-12具有有效的抗炎作用，可調節(jié)細胞生長、凋亡、炎性基因的轉錄等重要細胞過程(Egwuagu，2009)；JAK激酶和STAT蛋白參與了許多細胞因子的信號轉導，它在細胞因子介導的免疫反應和調控中具有重要作用(Shuai & Liu，2003)。綜上，這些基因表達水平的提高表明VRIL-4/6-2-CS誘導了更加全面的免疫應答，增強了仔豬的先天性和適應性免疫應答。

總之，本研究結果首次證實VRIL-4/6-2-CS可有效協(xié)同增強仔豬對PCV-2疫苗的免疫應答。VRIL-4/6-2-CS是一種新型高性價比佐劑，可提高豬對抗PCV-2感染的免疫預防能力，具有重要應用前景。

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