陳祎， 宋婷玉， 李金海， 肖永樂(lè)， 曾光志， 萬(wàn)小平，楊璐一， 方鵬飛*， 王澤洲， 高榮*

1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物疾病防控和食品安全四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610065；2. 四川省華派生物制藥有限公司，成都610026； 3. 四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，成都610035)

細(xì)胞因子因其安全性和高效性而成為一種理想的免疫佐劑，例如γ-干擾素(IFN-γ)(Wangetal.，2013)、白細(xì)胞介素2(IL-2)(Yangetal.，2010)、白細(xì)胞介素4(IL-4)(Zhangetal.，2007)和白細(xì)胞介素6(IL-6)(Lietal.，2011)。IL-2、IL-4和IL-6在細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)中起重要作用。IL-2具有多種生物學(xué)功能，包括促進(jìn)T細(xì)胞增殖和增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，刺激活化的B淋巴細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)免疫球蛋白分泌等(Collins & Oldham，1993)。IL-4可影響體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，如免疫球蛋白的產(chǎn)生、類別轉(zhuǎn)換和分泌(Pasquinietal.，1997)。IL-6具有促進(jìn)白細(xì)胞介素基因表達(dá)、B細(xì)胞分化、T細(xì)胞活化的作用(Kishimoto，2010)。

豬IL-2或IL-6與CpG免疫刺激序列的混合基因能有效提高動(dòng)物對(duì)病原菌的抵抗力(Yangetal.，2010；Huangetal.，2013)；此外，豬IL-4/6融合基因與單獨(dú)的IL-4和IL-6相比，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答；豬IL-4/6融合基因能加強(qiáng)大腸桿菌疫苗、豬肺炎支原體疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)疫苗對(duì)機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫，提高接種動(dòng)物的免疫保護(hù)性(Zhangetal.，2007；Zhangetal.，2012；Yangetal.，2013)；豬IL-2、IL-4、IL-6的融合基因(IL-4/6-2)相比于IL-4/6和IL-2在小鼠Musmusculus上可產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫協(xié)同調(diào)節(jié)作用(楊璐一等，2014)。

因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，為研制新型高性價(jià)比的PCV-2疫苗免疫調(diào)節(jié)劑，評(píng)估共表達(dá)IL-2和IL-4/6融合基因納米顆粒對(duì)仔豬生長(zhǎng)和PCV-2免疫應(yīng)答的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒：真核表達(dá)載體VR1020-豬融合白細(xì)胞介素4/6-2(VRIL-4/6-2)，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；殼聚糖(CS)：15 kD，脫乙酰度95%以上，購(gòu)自Sigma Aldrich；多聚磷酸鈉(TPP)：購(gòu)自Sigma(USA)；鱟試劑：購(gòu)自湛江A & C公司；疫苗：PCV-2滅活疫苗(ZJ/C株)(圓環(huán)康)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康21日齡長(zhǎng)白、約克夏和杜洛克雜交仔豬均由四川省華派生物制藥有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1VRIL-4/6-2真核表達(dá)質(zhì)粒的大量制備及內(nèi)毒素檢測(cè)參照《分子克隆指南 第三版》(Josephetal.，2002)制備質(zhì)粒，溶解于TE緩沖液，質(zhì)粒濃度和純度使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)；質(zhì)粒內(nèi)毒素含量用鱟試劑檢測(cè)。

1.2.2VRIL-4/6-2質(zhì)粒殼聚糖納米顆粒的制備離子交聯(lián)法(Bodmeieretal.，1989)制備VRIL-4/6-2質(zhì)粒殼聚糖納米顆粒。將殼聚糖溶解于1%的冰醋酸溶液(pH5.5)，配制為2.4 mg·mL-1的溶液；ddH2O配制10 mg·mL-1的磷酸三苯酯(TPP)溶液；以上溶液均用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。將VRIL-4/6-2質(zhì)粒與適量TPP溶液混勻，55 ℃孵育20 min；殼聚糖與質(zhì)粒質(zhì)量比為30∶1，在50～55 ℃水浴磁力攪拌下將質(zhì)粒與TPP的預(yù)混液緩慢滴加至殼聚糖溶液中，混合均勻，恒溫孵育10 min備用，記作VRIL-4/6-2-CS。用Zetasizer3000HS/IHPL粒度儀檢測(cè)納米顆粒粒徑和電位。

1.2.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)10頭21日齡長(zhǎng)白、約克夏和杜洛克雜交仔豬，經(jīng)ELISA和熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)PCV-2、PRRS病毒、豬瘟病毒和支原體均為陰性。隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5頭。實(shí)驗(yàn)組頸部肌肉注射2.5 mL VRIL-4/6-2-CS(0.5 mg·mL-1)，對(duì)照組注射相同劑量生理鹽水；2組均頸部肌肉注射2.5 mL PCV-2疫苗。豬免疫接種前記為第0天，接種后第7、14、28天定時(shí)采集前腔靜脈血用于檢測(cè)免疫反應(yīng)。接種前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束第28天時(shí)分別測(cè)量2組仔豬的體質(zhì)量，用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒對(duì)仔豬生長(zhǎng)的影響。

觀察組48例中，痊愈15例，顯效20例，有效10例，無(wú)效3例，總有效率為93.75%；對(duì)照組48例中，痊愈11例，顯效15例，有效12例，無(wú)效10例，總有效率為79.16%，觀察組明顯優(yōu)于對(duì)照組，兩組效果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

1.2.4PCV-2特異性抗體的測(cè)定取500 μL抗凝血低速離心后收集血清，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD630值，檢測(cè)血清中PCV-Ab的含量，試劑盒購(gòu)自武漢科前生物公司。

1.2.5IgG1和IgG2a的測(cè)定取500 μL抗凝血低速離心后收集血清，參照ELISA 試劑盒說(shuō)明書操作，在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD450值，檢測(cè)血清中IgG1和IgG2a的含量，試劑盒購(gòu)自成都敏鑫科生物科技公司。

1.2.6CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的測(cè)定取100 μL新鮮抗凝血搖勻，加入2 μL anti-porcine CD3-SPRD、2 μL anti-porcine CD4-FITC、2 μL anti-porcine CD8-PE，震蕩混勻避光孵育30 min；加入600 μL紅細(xì)胞裂解液，避光裂解10 min，500 r·min-1離心5 min，去上清；加入1 mL 磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，輕輕懸浮細(xì)胞，500 r·min-1離心5 min，去上清；重復(fù)洗滌1次，細(xì)胞沉淀加入300 μL PBS混勻，懸浮細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7熒光定量檢測(cè)基因表達(dá)水平100 μL抗凝血加入1 mL的RNAiso pius，充分裂解后提取細(xì)胞總RNA，用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for Qpcr (One-Step gDNA Removal)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)GenBank中的豬PPIA、TLR-2、TLR-7、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、STAT-1、STAT-2、STAT-3基因的cDNA序列，分別設(shè)計(jì)合成其特異性擴(kuò)增引物(表1)。

以仔豬不同時(shí)期血液cDNA為模板，表1中設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增。用Bio-Rad IQ5熒光定量PCR儀檢測(cè)不同基因相對(duì)表達(dá)的情況，15 μL體系，用SsoAdvanceTMUniversal SYBR Green Supermix進(jìn)行熒光定量分析。擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃變性 5 s，最佳退火溫度退火30 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線參數(shù)：65～95 ℃，每6 s上升0.5 ℃。PPIA為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法分析實(shí)時(shí)熒光PCR數(shù)據(jù)，比較同一目的基因不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)水平差異。

1.2.8數(shù)據(jù)分析以上各數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6中的雙因素方差分析和單因素方差分析進(jìn)行差異比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 熒光定量PCR特異性引物Table 1 The primers for qPCR

2 結(jié)果

2.1 仔豬體質(zhì)量變化

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始及結(jié)束時(shí)分別稱量每只仔豬的體質(zhì)量，分別計(jì)算每組仔豬體質(zhì)量的平均值和方差，仔豬體質(zhì)量變化見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組仔豬體質(zhì)量增加顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表2 實(shí)驗(yàn)28天仔豬體質(zhì)量變化Table 2 Body mass change of piglets during 28 days

注 Note：*P<0.05

2.2 仔豬血清中特異性抗體含量

在接種第7天后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中均可以檢測(cè)到PCV-2抗體，但是2組含量之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 仔豬血清中PCV-2抗體含量的變化Fig. 1 PCV-2 antibody titers in the serum of the experimental piglets

S/P=(S-N)/(P-N)=(樣品OD值-陰性對(duì)照OD值)/(陽(yáng)性對(duì)照OD值-陰性對(duì)照OD值)， 當(dāng)S/P≥0.16時(shí)， 認(rèn)為PCV-2抗體檢測(cè)為陽(yáng)性

S/P=(S-N)/(P-N)=(ODsample-ODnegative control)/(ODpositive control-ODnegative control)， titer of PCV-2 antibody was considered positive whenS/P≥0.16

2.3 仔豬血清中IgG1 和IgG2a 含量

實(shí)驗(yàn)組仔豬血清中IgG1的含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而IgG2a的含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖2)。

2.4 CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)仔豬血液中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量變化，實(shí)驗(yàn)組仔豬血液中的CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量與對(duì)照組相比均顯著增加(P<0.05)(圖3)。

2.5 免疫相關(guān)基因表達(dá)量分析

2.5.1Toll-like受體基因表達(dá)定量分析實(shí)驗(yàn)組TLR-2基因的表達(dá)水平只在免疫后第14天顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組TLR-7基因的表達(dá)水平在免疫后第28天顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖4)。

圖2 仔豬血清中IgG1和IgG2a含量的變化Fig. 2 The change of the levels of IgG1 and IgG2a in the serum of piglets

圖3 仔豬血液中 CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化Fig. 3 CD4+ and CD8+ T cell numbers in the blood of experimental piglets

2.5.2細(xì)胞因子基因表達(dá)定量分析實(shí)驗(yàn)組仔豬血液中IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α基因的表達(dá)水平在免疫后第28天均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中，IL-4和IL-6基因表達(dá)水平分別在第7天和第14天顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖5)。

2.5.3免疫信號(hào)傳導(dǎo)分子基因表達(dá)定量分析STAT-1基因表達(dá)水平在免疫后第7～14天均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，STAT-2基因表達(dá)水平在免疫后第14～28天顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，STAT-3基因表達(dá)水平在免疫后第7、28天顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖6)。

3 討論

細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫功能的關(guān)鍵分子。許多細(xì)胞因子被證實(shí)作為佐劑對(duì)體液或細(xì)胞免疫有增強(qiáng)作用(Pasquinietal.，1997；Kayamuroetal.，2010)。IL-2不僅支持T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化和增殖，還可以刺激和活化B淋巴細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)免疫球蛋白分泌(Smith，1988；Collins & Oldham，1993)。IL-4可促進(jìn)體液免疫，增加特異性和非特異性殺傷功能(Erbetal.，1997；Paul，2015)。IL-6可調(diào)節(jié)B細(xì)胞活化、抗體產(chǎn)生和Th1型免疫反應(yīng)(Paul & Seder，1994；Kishimoto，2006)。有研究表明，豬IL-4/6、IL-2和IL-4/6-2融合基因均可安全增強(qiáng)動(dòng)物系統(tǒng)和全面的免疫(Yangetal.，2010，2013；楊璐一等，2014)?；谝郧暗难芯?，本研究第一次將豬IL-4/6-2融合基因應(yīng)用到豬上，來(lái)加強(qiáng)對(duì)PCV-2疫苗的免疫效果。

圖4 仔豬TLR基因表達(dá)水平的變化Fig. 4 The change of expression levels of TLR gene in the blood of experimental piglets

圖5 仔豬細(xì)胞因子基因表達(dá)水平的變化Fig. 5 The change of cytokine gene expression in the blood of experimental piglets

圖6 仔豬免疫信號(hào)傳導(dǎo)分子基因表達(dá)水平的變化Fig. 6 The change of the immune signal transduction molecules related genes in the blood of experimental piglets

本實(shí)驗(yàn)用殼聚糖將重組質(zhì)粒VRIL-4/6-2包裹，制備殼聚糖納米顆粒，與PCV-2疫苗同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)仔豬進(jìn)行肌肉注射免疫接種。實(shí)驗(yàn)所用重組質(zhì)粒通過(guò)2A短肽連接3種白細(xì)胞介素基因，構(gòu)建共表達(dá)質(zhì)粒。2A短肽具有的自剪切機(jī)制使連接前后的基因表達(dá)量相同(de Felipe & Ryan，2004；Szymczak & Vignali，2005)。裸露的基因不穩(wěn)定且半衰期短，轉(zhuǎn)染效率低；而殼聚糖包裹質(zhì)?？尚纬尚〉膸д姾傻募{米顆粒，與裸露的質(zhì)粒相比，它可以更有效地?cái)y帶目的基因進(jìn)入細(xì)胞，還可以抑制其在生物體內(nèi)降解，被證實(shí)是一種有潛力的緩釋材料，并且還具有生物相容性(Chewetal.，2003；Cui & Mumper，2003)，因此，殼聚糖作為基因載體的研究發(fā)展迅速(Buschmannetal.，2013；Fernándezetal.，2016)。Huang等(2005)通過(guò)熒光標(biāo)記研究殼聚糖-DNA復(fù)合粒子進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程，證實(shí)了殼聚糖-DNA復(fù)合粒子可以被細(xì)胞內(nèi)吞，繼而進(jìn)行后續(xù)基因轉(zhuǎn)染。之前的研究也表明，殼聚糖納米粒子在動(dòng)物身上用于基因傳遞幾乎沒(méi)有毒性和影響(Yangetal.，2010；Zhangetal.，2012)，并且空白載體質(zhì)粒組與空白組沒(méi)有差異(Yangetal.，2010)。本次實(shí)驗(yàn)由于陰性動(dòng)物難于篩選獲得，數(shù)量有限，并未進(jìn)行空白載體質(zhì)粒組的實(shí)驗(yàn)。

在實(shí)驗(yàn)期間，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組仔豬注射局部均未出現(xiàn)病變、損傷或其他系統(tǒng)性癥狀。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)分別記錄了每只仔豬的體質(zhì)量，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組仔豬的生長(zhǎng)速率顯著高于對(duì)照組。有研究顯示，IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子可在豬小腸中持續(xù)表達(dá)，并且細(xì)胞因子除了直接的免疫調(diào)節(jié)作用，還可影響上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和免疫細(xì)胞的運(yùn)輸(Oswald，2006；Devriendtetal.，2010)。推測(cè)VRIL-4/6-2質(zhì)粒對(duì)調(diào)節(jié)仔豬內(nèi)分泌、促進(jìn)物質(zhì)代謝有積極作用。

PCV-2特異性抗體和PCV-2中和抗體是體液免疫反應(yīng)的重要檢測(cè)指標(biāo)(Meertsetal.，2006；Fortetal.，2007)。研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組仔豬血清中PCV-2抗體的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且實(shí)驗(yàn)組仔豬血清中IgG1的含量顯著低于對(duì)照組，這表明IL-4/6-2可能沒(méi)有明顯增強(qiáng)仔豬對(duì)PCV-2疫苗的體液免疫。此外，有研究顯示，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫對(duì)于PCV-2的防控很有必要(Fortetal.，2009)。本研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組，并且實(shí)驗(yàn)組的IL-2、TNF-α基因表達(dá)水平在第28天顯著高于對(duì)照組。IL-2、IFN-γ和TNF-α均由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，Th1細(xì)胞可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化、遲發(fā)性超敏反應(yīng)和IgG2a的產(chǎn)生(Mosmann & Coffman，1989；Abbasetal.，1996)。同時(shí)，本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組產(chǎn)生了更多的IgG2a抗體，表明實(shí)驗(yàn)組仔豬產(chǎn)生了更強(qiáng)的Th1型免疫應(yīng)答，相比對(duì)照組，VRIL-4/6-2-CS提高了仔豬對(duì)PCV-2疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

另外，實(shí)驗(yàn)組仔豬血液中IL-4、IL-6、TLR-2、TLR-7、STAT-1、STAT-2、STAT-3基因的表達(dá)水平在不同時(shí)間段內(nèi)也顯著高于對(duì)照組。TLRs是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，Toll-like受體在先天免疫中識(shí)別不同病原菌的保守分子模式，并參與對(duì)病原體的特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的激活(Kawai & Akira，2010)。STAT-1、STAT-2參與IFNs應(yīng)答反應(yīng)，并在干擾素抗病毒應(yīng)答調(diào)節(jié)中起重要作用(Mitchell & John，2005；Steen & Gamero，2013)；STAT-3可由多種細(xì)胞因子激活，例如IL-6、IL-12具有有效的抗炎作用，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、炎性基因的轉(zhuǎn)錄等重要細(xì)胞過(guò)程(Egwuagu，2009)；JAK激酶和STAT蛋白參與了許多細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，它在細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和調(diào)控中具有重要作用(Shuai & Liu，2003)。綜上，這些基因表達(dá)水平的提高表明VRIL-4/6-2-CS誘導(dǎo)了更加全面的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)了仔豬的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。

總之，本研究結(jié)果首次證實(shí)VRIL-4/6-2-CS可有效協(xié)同增強(qiáng)仔豬對(duì)PCV-2疫苗的免疫應(yīng)答。VRIL-4/6-2-CS是一種新型高性價(jià)比佐劑，可提高豬對(duì)抗PCV-2感染的免疫預(yù)防能力，具有重要應(yīng)用前景。

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