王循剛， 王守紅， 李玉龍， 張美華， 張夢(mèng)潔， 劉露莎， 江建平

1. 中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，成都610041； 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京210046)

飾紋姬蛙Microhylafissipes隸屬于兩棲綱Amphibia無(wú)尾目Anura姬蛙科Microhylidae姬蛙屬M(fèi)icrohyla，分布于東亞及東南亞地區(qū)，國(guó)內(nèi)主要分布于華東、華南、華北和西南部分地區(qū)，具有種群數(shù)量大、個(gè)體發(fā)育迅速、產(chǎn)卵量多、蝌蚪透明、一年多次產(chǎn)卵且繁殖期長(zhǎng)、變態(tài)時(shí)間短、性成熟較快等特點(diǎn)(費(fèi)梁等，2009)，在胚胎發(fā)育、適應(yīng)性機(jī)制、人類疾病及環(huán)境健康等方面有重要價(jià)值(Liuetal.，2016)。

目前，有關(guān)飾紋姬蛙的研究涉及多方面，耿寶榮等(1996)、劉紹龍等(1996)、徐夢(mèng)陽(yáng)和徐劍(2012)以及Wang等(2017)對(duì)飾紋姬蛙的胚胎發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了相關(guān)研究；薛清清等(2005)、郭賽男等(2014)采用靜態(tài)換水法研究了殺蟲(chóng)劑、除草劑及殺菌劑對(duì)飾紋姬蛙蝌蚪的急性毒性及聯(lián)合毒性，并對(duì)其進(jìn)行了安全性評(píng)價(jià)；韋力等(2013)、魏潔(2016)對(duì)飾紋姬蛙求偶鳴聲特征和繁殖特征進(jìn)行了研究；另外，還涉及生物地理學(xué)和群體遺傳學(xué)(Zhangetal.，2013；Yuanetal.，2016)、基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的變態(tài)發(fā)育和肺發(fā)育過(guò)程中重要基因調(diào)控的研究(Zhaoetal.，2016；Liuetal.，2017)。這些研究不僅促進(jìn)了飾紋姬蛙的模式化，也對(duì)飾紋姬蛙的人工飼養(yǎng)及人工繁育提出了要求。

本研究對(duì)飾紋姬蛙進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)馴化，并對(duì)其進(jìn)行人工繁育，分析實(shí)驗(yàn)室條件下飾紋姬蛙的繁

殖行為和產(chǎn)卵情況等，旨在完善人工繁殖和飼養(yǎng)技術(shù)，為研究工作提供適宜的研究材料，也可為無(wú)尾兩棲動(dòng)物的人工馴化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

188只飾紋姬蛙繁殖親本于2015年7月—2017年5月分別采自四川省雙流區(qū)(103.842 8°E，30.582 5°N)、四川省綿陽(yáng)市(104.192 2°E，31.354 4°N)、四川省樂(lè)山市(103.782 7°E，29.453 5°N)和海南省萬(wàn)寧市(110.478 3°E，18.946 7°N)(表1)。在實(shí)驗(yàn)室將雌雄分開(kāi)以每盒5只飼養(yǎng)在透明飼養(yǎng)盒A(長(zhǎng)32 cm×寬22 cm×高15 cm；模擬自然環(huán)境：盒中布置苔蘚、砂石，加少量水，并標(biāo)注產(chǎn)地、采集時(shí)間等信息；圖1：A)。每天定時(shí)投喂殘翅果蠅Drosophilamelanogaster，后期挑選具有優(yōu)良繁殖性狀的雌雄個(gè)體進(jìn)行人工催產(chǎn)。

表1 飾紋姬蛙樣本采集情況Table 1 Sampling information of Microhyla fissipes

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

電子秤(0.001 g)、游標(biāo)卡尺(0.01 mm)、一次性注射器(1 mL)、培養(yǎng)皿(直徑12 cm)、塑料吸管(3 mL)、注射用促黃體素釋放激素類似物A3(luteinizing hormone releasing hormone，LHRH-A3；寧波市三生藥業(yè)有限公司)、螺旋藻粉(中鹽制鹽工程技術(shù)研究院)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1雌雄親本的挑選挑選繁殖體征較好的雌雄親本，雌性選擇腹部較大且軟，從腹部能明顯看到成熟卵子的個(gè)體，其卵粒較大，動(dòng)植物極明顯(動(dòng)物極黑褐色，植物極乳白色)；雄性選擇能鳴叫，聲囊大且顏色較黑，腹部靠近泄殖腔位置發(fā)紅且有2條“V”形白線的個(gè)體。測(cè)量體質(zhì)量和體長(zhǎng)。

1.3.2人工催產(chǎn)將LHRH-A3用滅菌的0.65%生理鹽水配成注射液(3 μg·mL-1)，對(duì)飾紋姬蛙進(jìn)行腹腔注射(0.3 μg/g)。將注射后的飾紋姬蛙親本按雌雄1∶1置于繁殖飼養(yǎng)盒B(長(zhǎng)27 cm×寬17 cm×高15 cm；模擬自然環(huán)境：盒內(nèi)用青苔、水草、砂石進(jìn)行布置，水陸面積比為3∶2；圖1：B)，每盒雌雄各1只，并標(biāo)注編號(hào)。繁殖環(huán)境氣溫控制在28 ℃。注射LHRH-A3當(dāng)晚人工觀測(cè)繁殖行為，并記錄求偶過(guò)程和交配時(shí)間。為了將人為干擾程度降到最低，使用仿月光夜間燈照明，且避免光照對(duì)動(dòng)物飼養(yǎng)盒的直射。繁殖親本完成抱對(duì)產(chǎn)卵后，結(jié)束觀察。12 h左右后查看產(chǎn)卵情況，及時(shí)將受精卵從繁殖飼養(yǎng)盒B中取出并轉(zhuǎn)入大的白色飼養(yǎng)盒C(長(zhǎng)45 cm×寬32 cm×高11 cm；圖1：C)中進(jìn)行自然孵化。統(tǒng)計(jì)產(chǎn)卵總數(shù)、受精數(shù)、孵化數(shù)等，并再次稱量產(chǎn)卵后雌雄親本的體質(zhì)量以計(jì)算繁殖投入。數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

圖1 飼養(yǎng)盒 Fig. 1 Breeding containers

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 繁殖行為

對(duì)挑選好的飾紋姬蛙雌雄親本人工注射LHRH-A3催產(chǎn)，3 h后觀察記錄其繁殖行為，雄蛙會(huì)持續(xù)不間斷鳴叫一段時(shí)間，同時(shí)面朝雌蛙展示聲囊大小，求偶成功后抱對(duì)。產(chǎn)卵前，雌蛙會(huì)躁動(dòng)不安，然后躍入水中；產(chǎn)卵時(shí)，雌蛙漂浮于水面，將頭埋入水中，尾部上翹與雄蛙尾部貼近，抖動(dòng)，從泄殖腔排出卵粒，反復(fù)多次；產(chǎn)卵完畢后，雄蛙和雌蛙分開(kāi)。通過(guò)觀察，發(fā)現(xiàn)抱對(duì)持續(xù)時(shí)間為7～12 h。

2.2 產(chǎn)卵情況

2.2.1產(chǎn)卵量與繁殖周期2015年7月—2017年5月，飾紋姬蛙共有98次成功人工催產(chǎn)產(chǎn)卵的記錄，包括四川省雙流區(qū)、四川省樂(lè)山市、四川省綿陽(yáng)市、海南省萬(wàn)寧市4個(gè)不同地點(diǎn)的親本。其中，2015年繁殖成功8次，2016年繁殖成功53次，2017年繁殖成功37次。窩卵數(shù)15～1 100枚，平均每只雌蛙單次產(chǎn)卵310枚±203枚(n=98)。其中，海南省萬(wàn)寧市一組親本(編號(hào)：HN001P)于2016年8月13日采回，至2017年5月共成功繁殖產(chǎn)卵5次，產(chǎn)卵日期分別為2016年8月14日、2016年9月29日、2017年3月21日、2017年4月 6日和2017年5月5日。在2017年的繁殖實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，飾紋姬蛙同一親本2次繁殖時(shí)間間隔最小可縮短到16 d。

2.2.2雌雄親本大小對(duì)產(chǎn)卵量的影響共獲得76對(duì)成功產(chǎn)卵飾紋姬蛙親本的產(chǎn)卵前體質(zhì)量、體長(zhǎng)測(cè)量值。雌蛙體質(zhì)量1.30 g±0.36 g，體長(zhǎng)22.6 mm±1.9 mm；雄蛙體質(zhì)量1.05 g±0.24 g，體長(zhǎng)21.8 mm±2.1 mm。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，76對(duì)飾紋姬蛙平均成功產(chǎn)卵309枚±214枚，與雌蛙體質(zhì)量顯著正相關(guān)(R2=0.44，P<0.001，n=76；圖2)，與雄蛙體質(zhì)量、雌蛙體長(zhǎng)及雄蛙體長(zhǎng)均無(wú)相關(guān)關(guān)系。

2.2.3產(chǎn)卵量與雌雄親本繁殖投入的相關(guān)性共獲得32對(duì)繁殖親本產(chǎn)卵前后體質(zhì)量的測(cè)量值，雌蛙體質(zhì)量減少量為0.24 g±0.17 g，與產(chǎn)卵量顯著正相關(guān)(R2=0.47，P<0.001，n=32；圖3)。表明雌蛙繁殖投入與體質(zhì)量變化顯著相關(guān)，但產(chǎn)卵量與雄蛙體質(zhì)量變化無(wú)相關(guān)關(guān)系。

圖3 飾紋姬蛙窩卵數(shù)與雌蛙繁殖投入的關(guān)系Fig.3 Relationship between female reproductive input and the clutch size of Microhyla fisspes

2.3 動(dòng)物飼養(yǎng)

2.3.1蝌蚪的飼喂剛孵化的飾紋姬蛙蝌蚪靠體內(nèi)的卵黃提供營(yíng)養(yǎng)，待卵黃消失(蝌蚪發(fā)育至26期)(Wangetal.，2017)時(shí)以熟雞蛋黃開(kāi)口(少量多次投喂)。開(kāi)口1、2 d后飼喂螺旋藻粉，每天早晚各投喂1次。為保證水體中溶解氧含量高于 6 mg·L-1，用充氣泵24 h不間斷充空氣，并且每3 d換1次水。水溫控制在26 ℃，光照周期12L∶12D。

2.3.2幼蛙的飼喂完成變態(tài)的幼蛙(發(fā)育至45期)一般1～2 d后即可喂食，餌料為棘跳蟲(chóng)Onychiuyusfimeitayiuslinnaeus和白符跳Folsomiacandida。按1只幼蛙10～15只的投喂量投喂。每天投喂1次，根據(jù)進(jìn)食情況適當(dāng)增加或者減少投喂量。隨著幼蛙的生長(zhǎng)發(fā)育，一個(gè)月后逐漸過(guò)渡到飼喂殘翅果蠅。環(huán)境溫度保持26 ℃，相對(duì)濕度保持70%，光照周期12L∶12D。

2.3.3成蛙的飼喂成蛙主要投喂殘翅果蠅，每天投喂1次。按1只成蛙5～10只的投喂量投喂，并觀察采食情況。根據(jù)成蛙體型進(jìn)行合理密度的飼養(yǎng)調(diào)整。對(duì)于成功繁殖后代的雌雄親本，在飼養(yǎng)盒A中繼續(xù)飼養(yǎng)，并每隔15 d查看雌雄親本的身體狀況，以便后續(xù)人工繁殖。其他飼養(yǎng)環(huán)境條件與幼蛙一致。

3 討論

結(jié)合野外采集飾紋姬蛙的情況和實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)情況，推測(cè)其繁殖期為3—10月，其中5—8月為高峰期。人工繁殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同一對(duì)飾紋姬蛙親本在 9個(gè)月內(nèi)成功繁殖并產(chǎn)卵5次(平均產(chǎn)卵量為133枚±64枚)，且繁殖間隔可以縮短到16 d。蔡明章等(1991)曾發(fā)現(xiàn)一只雌性飾紋姬蛙一年可以產(chǎn)卵6次。因此，飾紋姬蛙具有繁殖期長(zhǎng)、繁殖間隔短、多次產(chǎn)卵等優(yōu)點(diǎn)，為其模式化提供了基礎(chǔ)條件。同時(shí)也說(shuō)明，本實(shí)驗(yàn)室的飼養(yǎng)條件可以滿足飾紋姬蛙的生長(zhǎng)和繁殖需求。

早期蛙類的人工繁殖(蔡明章，1980；陳世濂，張艷璇，1994)是將雄蛙處死以取其睪丸進(jìn)行人工受精，無(wú)法觀察其繁殖行為，因此后來(lái)選用LHRH-A3、絨毛膜促性腺激素(HCG)等激素類針劑對(duì)兩棲動(dòng)物進(jìn)行人工催產(chǎn)(潘炯華，梁淡茹，1990；劉韜等，2009；唐秀鋒等，2016)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，對(duì)飾紋姬蛙注射LHRH-A3的效果好于HCG。這對(duì)今后實(shí)驗(yàn)室無(wú)尾兩棲動(dòng)物的人工繁殖提供了一定的參考。

此外，雌蛙產(chǎn)卵量與親本體質(zhì)量、體長(zhǎng)相關(guān)性比較結(jié)果表明，在整個(gè)繁殖過(guò)程中，雌蛙的身體指標(biāo)至關(guān)重要，這與其他多數(shù)研究結(jié)果一致(Kozlowska，1971；Gibbons & Mccarthy，1986；李斌，盧欣，2004)。同時(shí)，雌蛙的繁殖投入與產(chǎn)卵量也呈顯著正相關(guān)關(guān)系，即雌蛙經(jīng)歷一次繁殖，產(chǎn)卵量越多，體質(zhì)量減少越多。因此，在進(jìn)行蛙類人工繁殖時(shí)，應(yīng)該選擇體型較大、繁殖性狀較好的雌性個(gè)體進(jìn)行催產(chǎn)，以便獲取更多更好的實(shí)驗(yàn)材料；為了后續(xù)多次優(yōu)質(zhì)產(chǎn)卵，促進(jìn)體況盡早恢復(fù)至關(guān)重要。

本研究中，在蝌蚪早期餌料選擇時(shí)，首先用魚(yú)餌料和蛋黃一天2次交替飼喂，但無(wú)論是蛋黃還是飼料都很容易破壞水質(zhì)，需要勤換水，不僅給蝌蚪造成不良應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)加大工作量。后期又嘗試飼喂豐年蝦，效果有了一定改善。通過(guò)不斷地實(shí)驗(yàn)探索，發(fā)現(xiàn)以螺旋藻粉飼喂飾紋姬蛙蝌蚪效果最好，更符合其自然取食的種類和環(huán)境。螺旋藻粉既不容易壞水，蝌蚪也比較喜食，生長(zhǎng)狀況較好。變態(tài)后幼蛙和成蛙的飼養(yǎng)相對(duì)蝌蚪容易，模擬野外取食習(xí)性，幼蛙投喂跳蟲(chóng)，亞成體及成蛙投喂殘翅果蠅。經(jīng)過(guò)近2年的飼養(yǎng)馴化，不論是蝌蚪、幼蛙還是成蛙，都已經(jīng)對(duì)固定的餌料投喂有了很好的適應(yīng)性，并且建立了餌料飼養(yǎng)體系，即“熟蛋黃-螺旋藻粉(飼喂蝌蚪)-跳蟲(chóng)(飼喂剛變態(tài)的幼蛙)-殘翅果蠅(飼喂亞成體和成體蛙)”，為成功進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室人工馴養(yǎng)繁殖飾紋姬蛙提供了基礎(chǔ)保障。

致謝：楊登為、曾一唯、常利明同學(xué)在飾紋姬蛙野外采集過(guò)程中給予了幫助，王燕老師在動(dòng)物飼養(yǎng)方面提供了指導(dǎo)和幫助，謹(jǐn)此一并衷心感謝。

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