謝 月，梁 紅 ，宋立全 ，王清波，付東風，高大文，

（1.哈爾濱工業(yè)大學城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，哈爾濱 150090；2.東北林業(yè)大學林學院，哈爾濱150040；3.黑龍江三江國家自然保護區(qū)管理局，黑龍江 撫遠 156500）

氨氧化微生物包括氨氧化細菌（Ammonia-oxi dizing bacteria，AOB）和氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea，AOA），二者共同參與在好氧條件下將NH+4氧化為NO-2的過程，是氮循環(huán)的關鍵限速步驟[1]。人們曾一度認為氨氧化過程是由AOB獨立完成[2]，直到AOA基因組序列中發(fā)現(xiàn)存在參與氨氧化過程的關鍵功能基因——氨單加氧酶A基因（amoA）[3]以及第一株AOA Nitrosopumilus maritimus SCM1的成功分離和純培養(yǎng)[4]，才逐漸完善了我們對氮循環(huán)的理解[5]。同功微生物的出現(xiàn)使得探索在不同生境中AOA與AOB對氮循環(huán)的相對貢獻成為研究熱點。有研究認為氨氧化微生物的相對貢獻取決于AOA與AOB功能基因amoA的相對豐度，通過衡量不同生境中amoA的拷貝數(shù)的多少來判斷AOA/AOB在氮循環(huán)過程中占據(jù)主導地位的強弱[5-7]。后來人們逐漸認識到基因的豐度并不能完全反映其功能，于是將豐度與活性結合起來考慮，發(fā)現(xiàn)在土壤生態(tài)系統(tǒng)中雖然AOA在數(shù)量上較AOB更占優(yōu)勢，但硝化活性的變化卻與AOB的amoA拷貝數(shù)成正比，并且在同位素實驗中也證實了CO2的同化是由AOB完成的，意味著豐度并不高的AOB才是行使氨氧化功能的主要推動者[8]。探索豐度與活性之間的相互關系對明晰AOA和AOB所發(fā)揮的生態(tài)學功能具有重要的研究意義。

濕地被認為是“地球之腎”，擁有豐富的資源、獨特的生態(tài)結構和功能，在生物氮循環(huán)過程中發(fā)揮著重要的作用[9]。三江國家級自然保護區(qū)（簡稱三江濕地）地處黑龍江省撫遠縣境內，位于我國最大的沼澤分布區(qū)——三江平原，是東北溫帶濕地中極具代表性的酸性土壤的沼澤濕地。扎龍國家級自然保護區(qū)（簡稱扎龍濕地）地處黑龍江省齊齊哈爾市，該地區(qū)部分洼地為弱堿性淡水沼澤區(qū)。兩濕地均被列入《國際重要濕地名錄》。兩濕地對于研究東北沼澤濕地土壤具有良好的代表性，但國內外學者對于三江濕地、扎龍濕地的研究大多集中在對土壤養(yǎng)分以及微生物活性特征方面的研究上[10-12]，對于其中氨氧化微生物的活性以及豐度的研究少之又少。

本文以三江濕地和扎龍濕地的表層土壤為研究對象。在ISO 15685—2012的土壤快速檢測氨氧化方法的基礎上，利用特異性抑制劑進一步區(qū)分AOA、AOB的潛在氨氧化活性（Potential ammonia oxidation activity，PAO）。在PAO測定以及功能基因amoA絕對定量分析的基礎上，探究濕地土壤中PAO、豐度、環(huán)境因子之間的關系以及植被差異對PAO和豐度的影響，旨在為濕地生態(tài)系統(tǒng)中的氨氧化微生物研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

三江濕地取樣地點的地理坐標為48.149 607°～48.156 843°N，134.605 912°～134.608 272°E，位于三江平原的東北邊緣，具有三江平原內陸淡水沼澤濕地的典型特征。氣候屬于濕潤大陸性季風氣候，年平均降水量約600 mm，年平均氣溫2.2℃[13]。土壤類型主要有草甸土和沼澤土。取樣地的植物優(yōu)勢種群為毛苔草、小葉章。毛苔草植被生長在常年積水區(qū)，小葉章生長在季節(jié)性集水區(qū)。采樣區(qū)域土壤表層有較深厚的半泥炭化的草根層，其次為腐殖質層，腐殖質含量較高[14]。

扎龍濕地取樣地理坐標47.175 952°～47.176 382°N，124.229 723°～124.230 377°E，采樣地植被的優(yōu)勢種群為小葉章。

1.2 土壤樣品的采集

對三江濕地于2016年進行了連續(xù)4個月的取樣（7月25日、8月25日、9月25日、10月24日），采集表層土壤（0～20 cm）。扎龍濕地于2016年采集了生長季（7月25日）和非生長季（10月22日）表層土壤（0～20 cm）2次。采樣時首先去除表層2 cm的表層土壤，然后在取樣地內采用S形隨機選取10個樣點，記錄每個樣點的坐標，之后的采樣也依據(jù)此坐標，將采集的新鮮土樣放于無菌袋中，低溫保存，迅速帶回實驗室。將采集的平行樣等量分為兩份，一份保存于4℃冰箱中，用于理化性質以及PAO的測定，另一部分放于-80℃冰箱中，用于提取DNA。

1.3 土壤樣品的理化指標分析

NO-3、NH+4含量測定：取5 g新鮮土壤樣品，用25 mL的1 mol·L-1的KCl溶液浸提，對浸提液使用流動分析儀（Skalar San++）檢測。

pH值的測定：將5 g新鮮土壤樣品加入12.5 mL去離子水（水土比為2.5∶1），采用pH計檢測pH值。采用烘干測重法測定土壤含水率。所有樣品設置3個重復，具體理化指標見表1。

1.4 土壤樣品PAO測定

PAO是指土壤或沉積物中參與氨氧化作用的微生物在飽和基質濃度下氧化氨氮的最大能力，與原位的PAO不一定是等同的[15]。PAO在一定程度上反映土壤中氨氧化微生物的生態(tài)功能及其硝化活性的強弱。

表1 土壤理化指標Table1 Soil physical and chemical indicators

根據(jù)ISO 15685，利用氯酸鹽抑制亞硝酸鹽氧化菌（Nitrite-oxidizing bacteria，NOB），快速檢測土壤中氨氧化微生物的PAO[16]。稱取25 g新鮮土壤樣品，添加100 mL的1 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（K2HPO40.2 mol·L-1；KH2PO40.2 mol·L-1；pH 7.2）、1.5 mmol·L-1的（NH4）2SO4、10 mmol·L-1的 NaClO3來抑制亞硝酸鹽氧化，（25±2）℃，175 r·min-1，避光培養(yǎng)。從開始培養(yǎng)后每隔 1 h 取一次樣（1、2、3、4、5、6 h），每次取樣設置 3 個重復。每次取1 mL土壤混合液置于50 mL離心管中，添加2 mL 4 mol·L-1KCl溶液來終止氨氧化過程。3000×g離心2 min，取上清液加入鹽酸N-（1-萘基）-乙二胺顯色劑，在波長543 nm下用分光光度法測定NO-2的含量。對培養(yǎng)時間和NO-2的含量作圖，在培養(yǎng)的前6 hNO-2的含量能呈線性增加，斜率即可作為PAO，AOA和AOB共同作用下的PAO，記做PAO（AOA+AOB）。結合Zhou等[17]和Zheng等[18]的實驗方法，另一組實驗在此基礎上添加1 g·L-1的氨芐青霉素（Amp）來抑制AOB活性，只有AOA單獨發(fā)揮作用記做PAO（AOA），以此區(qū)分AOA和AOB的相對貢獻。

1.5 土壤DNA的提取

稱取 0.5 g土壤樣品，利用 TENP（50 mmol·L-1Tris，20 mmol·L-1EDTA，100 mmol·L-1NaCl，0.01 g·mL-1PVPP，定容至500 mL，pH=10）緩沖液渦旋振蕩，12 000 r·min-1室溫離心5 min，離心棄上清，反復4次直到緩沖液沖洗過后顏色變淡，使用PBS緩沖液（1 mol·L-1Tris-HCl，0.5 mol·L-1EDTA，5 mol·L-1NaCl）沖洗一次以去除腐植酸。將預處理后的土壤樣品經過FastDNARSPIN Kit for Soil試劑盒提取總DNA，最后采用80 μL DES洗脫。DNA的純度和濃度采用nanodrop8000檢測，提取的土壤DNA儲存在-20℃冰箱中。

1.6 功能基因amoA的定量

利用AOB的特異性引物amoA1F/amoA2R和AOA的特異性引物Arch-amoA F/Arch-amoA R進行PCR擴增，PCR產物經過SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化后連接在PUCm-T載體上，導入大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細胞中，藍白篩挑取陽性克隆制作標準質粒。AOA和AOB中amoA的豐度采用SYBR Green I方法測定。反應體系為20 μL包括2×SGExcel FastSYBR Mixture 10 μL，正反引物各 0.4 μL，模板DNA 0.8 μL，RNase-Free ddH2O 補足至 20 μL。每個樣品做3個平行并設置陰性對照。擴增儀為ABI 7500 Real-Time PCR System，AOA擴增程序為94℃預變性 5 min；94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)。AOB擴增程序為94℃預變性5 min；94℃變性 30 s，53℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，30個循環(huán)。AOB標準質粒稀釋6個濃度1.36×1010～1.36×105copies·μL-1（相鄰濃度相差10倍），AOA標準質粒稀釋8個濃度1.27×1010～1.27×103copies·μL-1（相鄰濃度相差10倍）產生標準曲線r2分別為0.980 6、0.995 8，擴增效率分別為93%、100%。在4個溫度步驟之后，設置溶解曲線從60～95℃，分析用于檢測產物的特異性，單一峰均出現(xiàn)在目的產物Tm值附近，產物特異性良好。

2 結果與討論

2.1 不同pH值的濕地土壤中氨氧化微生物的活性與豐度

2.1.1 兩種pH條件下氨氧化微生物的活性

根系分泌物中含有的豐富營養(yǎng)物質不僅能為植物根際微生物的生長和繁殖提供養(yǎng)分，也會影響土壤微生物的種類和數(shù)量[19]。在表層植被均為小葉章的情況下，中性的扎龍濕地土壤和酸性的三江濕地土壤生長季與非生長季的PAO見圖1。

在扎龍濕地中性的土壤中生長季的PAO（AOA+AOB）高于非生長季，而三江濕地酸性的土壤中非生長季的PAO（AOA+AOB）高于生長季。對比分析兩地區(qū)的環(huán)境因子，可能與非生長季三江濕地土壤的pH上升有關。在兩濕地土壤中AOA和AOB共同作用下的PAO均高于AOA單獨作用下。在10月末三江濕地中未檢測到PAO（AOA）。在生長季三江濕地土壤 PAO（AOA+AOB）和 PAO（AOA）較扎龍濕地土壤的低。對環(huán)境因子（pH、NO-3、NH+4、含水率）與PAO進行Pearson相關性分析，發(fā)現(xiàn)只有pH能顯著影響PAO（AOA）（r=0.99，P＜0.01）。

2.1.2 兩種pH條件下的氨氧化微生物的豐度

圖1 兩種不同類型濕地土壤中氨氧化微生物的活性Figure 1 The PAO of two different types of wetland soil

圖2 兩種不同類型濕地土壤中氨氧化微生物的豐度Figure 2 The abundance of AOB and AOA from two different types of wetland soil

從圖2可以看出，生長季三江濕地土壤中AOB的豐度明顯高于AOA豐度。而非生長季三江濕地、扎龍濕地AOA豐度與AOB豐度相差不大。兩濕地非生長季AOA/AOB豐度之比較生長季有所上升。扎龍地區(qū)非生長季氨氧化微生物的豐度較生長季有所下降，但AOA/AOB有所上升（從0.9到1.18）。三江濕地AOA/AOB從生長季0.08上升到非生長季1.24。通過對理化指標、AOA和AOB的豐度和活性進行Pearson相關性分析，得出AOA的豐度與PAO（AOA+AOB）呈現(xiàn)顯著正相關（r=0.96，P＜0.05），結論與Zheng等[18]報道相同。但AOA的豐度卻與PAO（AOA）不存在相關性（P＞0.05）。雖然在不同環(huán)境中AOA和AOB的amoA數(shù)量可能相差懸殊[1，18，20]，但這并不意味著功能基因的數(shù)量多就一定能夠在氨氧化過程中表達基因，進而發(fā)揮關鍵性作用。AOA的豐度與PAO（AOA）不存在相關性，推測原因是1 g·L-1的Amp抑制了部分AOA活性。Santoro等[21]在研究加州中部海域水體時也發(fā)現(xiàn)，硝化速率并未直接與AOA/AOB的豐度呈現(xiàn)相關關系。土壤中NO-3濃度也是影響AOA豐度的重要原因（r=0.954，P＜0.05）。

2.2 不同植被下濕地土壤中氨氧化微生物的活性與豐度

2.2.1 不同植被土壤中氨氧化微生物的活性

對比三江濕地土壤中以毛苔草與小葉章為主要植被的土壤中PAO（AOA+AOB）（圖3），由生長季向非生長季過渡的時間內總體PAO（AOA+AOB）呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢。在7月末之前毛苔草土壤的PAO（AOA+AOB）要高于小葉章土壤，在此之后則相反，可能是受連日降雨影響[22]，7月末樣地積水位明顯上升，導致7月末兩種植被下表層土壤中氨氧化微生物活性大幅降低。對比圖3、圖4，其中7月15日樣品中的活性值均高于之后4次所測得的值，可能也與樣地的漲水以及7月末氣溫降低等因素有關。漲水持續(xù)至9月初，取樣地中毛苔草一直生長在淹水環(huán)境，而小葉章生長在遠離淹水區(qū)的地帶，在8月末時可能由于小葉章已適應了浸水的環(huán)境，而毛苔草由于漲水被完全浸沒其中，使得小葉章PAO（AOA+AOB）開始上升，甚至高于毛苔草。

圖3 三江濕地毛苔草與小葉章植被下土壤PAO（AOA+AOB）Figure 3 The PAO（AOA+AOB） of Calamagrostis angustifoliaand Carex lasiocarpa in Sanjiang wetland

圖4 三江濕地毛苔草與小葉章植被下土壤PAO（AOA）Figure 4 The PAO（AOA） of Calamagrostis angustifolia and Carex lasiocarpa in Sanjiang wetland

結合5次采樣，對抑制AOB前后活性進行配對樣本t檢驗，發(fā)現(xiàn)在毛苔草土壤中，抑制AOB后PAO有顯著降低（P＜0.05）。表明毛苔草土壤中AOB在氨氧化過程中發(fā)揮重要作用。但是小葉章濕地土壤中抑制AOB前后的PAO值沒有顯著差異。

在濕地中，硝化作用主要與沉積物[21]、植物根系所形成的微氧環(huán)境以及周圍環(huán)境[23]有關。植物根系能釋放出低分子量的化合物作為碳源供給微生物生長，同時也可能與微生物產生競爭作用，競爭氨、尿素、硝酸鹽、氨基酸等[24]。研究表明，濕地植被能影響氨氧化微生物的活性[25]，而與土樣的理化指標無關[26]。但在本實驗中植被的差異對 PAO（AOA+AOB）和 PAO（AOA）并無顯著影響，表明植被的差異并不會影響到潛在氨氧化活性。

對環(huán)境因子（pH、NO-3、NH+4、含水率）與PAO進行相關性分析，pH顯著影響PAO（AOA+AOB）（r=-0.703，P＜0.05）以及PAO（AOA）（r=-0.865，P＜0.01）。

2.2.2 不同植被土壤中氨氧化微生物的豐度

如圖5所示，三江小葉章濕地土壤中AOA的豐度呈現(xiàn)先增加后減少趨勢，在8月末出現(xiàn)最大值。AOB豐度呈逐漸降低的趨勢，在10月末之前AOB豐度均高于AOA。

如圖6所示，在毛苔草植被土壤下AOA的豐度呈現(xiàn)先增加后減少再增加的趨勢，在8月末出現(xiàn)最大值。在生長季（7月、8月）AOA的豐度均高于AOB，而非生長季則相反。

圖5 三江小葉章植被土壤中氨氧化微生物豐度Figure 5 The abundance of AOB and AOA of Carex lasiocarpa in Sanjiang wetland

圖6 三江毛苔草植被土壤中氨氧化微生物豐度Figure 6 The abundance of AOB and AOA of Calamagrostis angustifolial in Sanjiang wetland

有文獻表明在酸性環(huán)境中AOA的豐度要高于AOB[27]，而在本文中大多數(shù)情況下AOB的豐度稍高。但不同植被下AOA和AOB的豐度沒有顯著差異，未發(fā)現(xiàn)影響氨氧化微生物豐度的環(huán)境因子。有研究表明在高NH+4濃度情況下AOB較AOA在氨氧化過程中更占主導位置[28]，毛苔草植被的土壤NH+4濃度高于小葉章植被，這也可能是在毛苔草植被土壤中AOB發(fā)揮重要作用的原因，但NH+4濃度與AOB的豐度之間并無顯著的相關關系。

3 結論

（1）pH值極顯著地影響 AOA的PAO（r=0.99，P＜0.01）。AOA 的豐度與 PAO（AOA+AOB）呈現(xiàn)顯著正相關（r=0.96，P＜0.05），而與 PAO（AOA）不存在相關性。

（2）在毛苔草濕地土壤中，抑制AOB后PAO顯著降低（P＜0.05），毛苔草濕地土壤中AOB在氨氧化過程中發(fā)揮重要作用。

（3）不同植被土壤中氨氧化微生物的PAO（AOA+AOB）、PAO（AOA）以及AOA與AOB豐度值并無顯著差異。

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