劉 璐 ，劉 萱 ，王 華 ，*，趙慧敏 ，于春艷 ，冷金慧 ，耿 聰 ，李章良

（1.大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院，遼寧 大連 116023；2.大連理工大學環(huán)境學院，遼寧 大連 116024；3.莆田學院環(huán)境與生物工程學院，福建省新型污染物生態(tài)毒理效應與控制重點實驗室，生態(tài)環(huán)境及其信息圖譜福建省高等學校重點實驗室，福建 莆田351100；4.國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，遼寧大連 116023）

磺胺類抗生素是一類具有廣譜抗菌活性的人畜共用抗菌劑，被廣泛用于醫(yī)療、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖等領域[1]。動物對磺胺類抗生素的排泄率為67%～90%[2]，大量的磺胺類抗生素最終會進入地表水環(huán)境中[3]。水環(huán)境中的抗生素增加了水中微生物存活的選擇性壓力，使可攜帶抗生素抗性基因（Antibiotic resistant genes，ARGs）的耐藥微生物成為水環(huán)境中的優(yōu)勢種。因而，磺胺類抗生素引發(fā)的磺胺類抗性基因污染受到人們的關注。目前，磺胺類抗性基因（Sul1、Sul2和Sul3）已在河流、河口及水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)附近等水環(huán)境中檢出[4-8]。其中，Sul1是在水環(huán)境中含量較高、分布相對廣泛的磺胺類抗性基因[9-10]。

天然水環(huán)境的水質(zhì)狀況可能會影響抗生素抗性基因的水平轉移，進而影響抗生素抗性基因的擴散。Bergeron等[11]對美國路易斯安那州東南部濕地中ARGs的分布特征進行研究發(fā)現(xiàn)，鹽度對ARGs含量具有顯著影響。張俊等[12]研究結果表明，pH變化對四環(huán)素ARGs的含量具有顯著影響。另外，水中營養(yǎng)元素水平可能對ARGs的分布和傳播有直接或間接的影響[13-14]。本研究選取Sul1為目的基因，采用絕對定量PCR技術，考察了5種水環(huán)境因子（pH、鹽度、腐植酸、總氨氮和活性磷酸鹽）對Sul1含量的影響，以期為水環(huán)境中磺胺類抗生素抗性基因的生態(tài)環(huán)境風險評估提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 Sul1型模擬實驗菌的構建

從水環(huán)境樣品中提取基因組DNA，擴增出長度為476 bp的Sul1基因，經(jīng)1.5%1×TAE瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化后，連接至pMD18-T克隆載體[寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司]，轉入E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，再通過藍白斑篩選挑取含目的基因的陽性菌落，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)過夜。采用質(zhì)粒提取試劑盒[寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司]在所得菌液中提取包含Sul1基因的pMD18-T/Sul1質(zhì)粒，所得菌液命名為Sul1型模擬實驗菌，將質(zhì)粒送于生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2 Sul1熒光定量PCR方法的建立及標準曲線的繪制

經(jīng)Nanodrop核酸定量儀測定質(zhì)粒的濃度及純度，將標準質(zhì)粒用超純水稀釋成1010～102copies·μL-1的 9 個濃度，選取 107、106、105、104、103和 102這 6 個濃度作為模板，以0.3 μmol·L-1的Sul1F和Sul1R為特異引物，并加入10 μL的 SYBR Premix Dimer Eraser（2×）、0.4 μL 的 ROX Reference DyeⅡ（50×）和 6.4 μL的無菌水，反應體系20 μL。熒光定量PCR反應條件：95℃預變性 5 min；95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸30 s，進行35個循環(huán)；72℃延伸7 min。每個反應進行3次重復，并設置空白對照。以SYBR-Green I熒光染料法，應用Step-one定量PCR儀（ABI，美國）繪制Sul1的標準曲線。繪制出的Sul1標準曲線為Y=-3.50lgX+39.03，熔解曲線具有特異性，決定系數(shù)R2為0.984，相對效率達96%。熒光定量PCR中所用試劑均購于寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司。

1.3 環(huán)境因子對Sul1含量的影響

在100 mL錐形瓶中加入10 mL LB肉湯培養(yǎng)基，加入0.01 mL Sul1型模擬實驗菌，Sul1的初始濃度為1.10×105copies·mL-1。所有實驗均設置 3 組平行，同時設置空白對照。pH對Sul1含量的影響試驗：通過150 g·L-1NaOH 或（1+5）HCl溶液調(diào)節(jié) LB 肉湯培養(yǎng)基 pH 的初始值分別為 3、4、5、6、7、8、9、10 和 11；鹽度對Sul1含量的影響試驗：通過NaCl溶液（200 g·L-1）將空白培養(yǎng)基鹽度 20 逐漸增加至 25、30、35、40和45；設置LB肉湯培養(yǎng)基的總氨氮（NH3-N）、活性磷酸鹽（PO4-P）、腐植酸（HA）的初始濃度分別為 0、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg·L-1。所有實驗組均經(jīng) 37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后，取1.5 mL菌液，采用MiniBEST Bacteria Genomic DNA試劑盒 [寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司]提取各實驗組的菌液基因組DNA，經(jīng)過1.5%的 1×TAE 瓊脂糖凝膠電泳（220 V，15 min，美國伯樂公司），純度的測定采用微量核酸定量儀（賽默飛科技有限公司，美國）。Sul1含量的單因素方差分析（One-way ANOVA）應用SPSS 17.0軟件計算，其中P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著；并使用O-rigin 8.60進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 pH和鹽度對磺胺類抗性基因Sul1含量的影響

圖 1 為 pH 初始值分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0時對Sul1含量的影響。當Sul1的初始濃度為 1.10×105copies·mL-1、pH 值為 3～11時，Sul1基因含量的變化范圍為 4.66×104～1.14×108copies·mL-1。當pH值為11時，Sul1的平均含量僅為4.66×104copies·mL-1；而 pH 值為 6 時，Sul1 的平均含量達到1.14×108copies·mL-1，其含量極顯著高于酸性（pH 3～5）和堿性（pH 9～11）條件（P＜0.01）。由此可見，中性pH適于抗性大腸桿菌的生長，間接促進了Sul1的含量增加，而酸性和堿性pH條件對Sul1的含量均呈現(xiàn)顯著的抑制作用。

pH是重要的水質(zhì)指標，其過高或過低，都會直接影響水環(huán)境中抗性細菌菌落數(shù)量，進而影響到ARGs的存在和傳播。本實驗結果顯示pH值為6時，Sul1的平均含量達到1.14×108copies·mL-1，顯著高于其他pH條件（P＜0.01），表明ARGs在環(huán)境中增殖和傳播的最適pH值在6左右。

圖1 pH對磺胺類抗性基因Sul1含量的影響Figure 1 Impact of pH on the content of sulfonamide resistance gene Sul1

圖2為鹽度對磺胺類抗性基因Sul1含量的影響，結果表明鹽度對Sul1的含量有著極顯著的影響（P＜0.01）。鹽度從20上升到45，Sul1含量的變化范圍從 1.04×108copies·mL-1下降到 8.34×105copies·mL-1，這意味著鹽度增加對Sul1的含量有明顯的抑制作用。這可能是在高鹽度條件下，細菌為了保持自身生命活動，避免鹽度對其內(nèi)部的生物化學反應造成干擾，細菌細胞膜阻止了絕大部分的外界物質(zhì)進入，進而影響了Sul1的含量。

圖2 鹽度對磺胺類抗性基因Sul1含量的影響Figure 2 Impact of salinity on the content of sulfonamide resistance gene Sul1

鹽度是影響細菌與外部環(huán)境發(fā)生物質(zhì)與能量交換的一個重要因素，其高低決定了細菌滲透壓的變化，從而直接影響細菌的活性。本研究中鹽度從20提高到45，Sul1的含量顯著下降了近 3個數(shù)量級。Bergeron等[11]對美國路易斯安那州東南部濕地中ARGs的分布特征進行研究，結果顯示鹽度為6的采樣點區(qū)域的ARGs分布和含量顯著高于鹽度為12的采樣點區(qū)域，這個結果與本實驗一致，證實了水環(huán)境中鹽度可能對ARGs的分布和傳播造成影響。

2.2 腐植酸對磺胺類抗性基因Sul1含量的影響

圖3為不同濃度的HA對Sul1含量的影響。當無 HA 時，24 h 后，Sul1含量上升到 1.04×108copies·mL-1。HA 濃度為 0.05 mg·L-1時，Sul1 含量下降至1.00×108copies·mL-1，差異不顯著（P=0.130）。而當 HA濃度高于0.05 mg·L-1時，隨其濃度的升高，Sul1含量極顯著降低（P＜0.01），表明高濃度的HA（大于0.05 mg·L-1）對 Sul1 含量呈現(xiàn)顯著的抑制作用（P＜0.01），這可能是由于HA附著在E.coli-sul1細胞膜表面，影響了細胞從培養(yǎng)基中吸收必要的營養(yǎng)物質(zhì)，間接影響了Sul1的增殖和傳播。

圖3 腐植酸（HA）對磺胺類抗性基因Sul1含量的影響Figure 3 Impact of humic acid（HA）on the content of sulfonamide resistance gene Sul1

HA是天然水環(huán)境中廣泛存在的重要吸光物質(zhì)，是水體中色度構成和溶解性有機質(zhì)（Dissolved organic matter，DOM）的主要成分[15]。HA含有大量的環(huán)狀（苯環(huán)、稠苯環(huán)等）結構和多種官能團（羧基、酚羥基、酮基、胺基等），易與水環(huán)境中的抗生素或金屬離子形成絡合物或螯合物[16]。近年來，Chen等[17]研究表明，水溶液中DOM的存在，使四環(huán)素與其形成絡合物，降低了四環(huán)素對E.coli的生物有效性，進而減弱了ARGs的篩選壓力。本研究結果進一步證實，即使抗生素不存在時，高濃度的HA可能直接影響磺胺類抗性基因Sul1在水環(huán)境中的傳播。

2.3 總氨氮和活性磷酸鹽對磺胺類抗性基因Sul1含量的影響

圖4為NH3-N對磺胺類抗性基因Sul1含量的影響。由圖4可見，低濃度的NH3-N對Sul1的含量呈促進作用，而高濃度呈抑制作用。當無NH3-N存在時，培養(yǎng)24 h后，Sul1基因含量達到7.30×107copies·mL-1；隨著 NH3-N 濃度提高到 0.05 mg·L-1，Sul1含量增長到 9.97×107copies·mL-1；NH3-N 濃度為 0.05～0.2 mg·L-1時，對 Sul1 含量表現(xiàn)出促進作用（P＜0.05）；NH3-N濃度為0.5 mg·L-1時，對Sul1含量具有抑制作用；當NH3-N濃度提高到1 mg·L-1，Sul1含量降低到 5.87×107copies·mL-1?？梢?NH3-N 濃度高于 0.5 mg·L-1時，對Sul1含量具有顯著的抑制作用（P＜0.05）。

圖4 總氨氮（NH3-N）對磺胺類抗性基因Sul1含量的影響Figure 4 Impact of ammonia nitrogen（NH3-N）on the content of sulfonamide resistance gene Sul1

圖5 活性磷酸鹽（PO4-P）對磺胺類抗性基因Sul1含量的影響Figure 5 Impact of available phosphate（PO4-P）on the content of sulfonamide resistance gene Sul1

圖5為PO4-P對磺胺類抗性基因Sul1含量的影響。圖5表明，當無PO4-P時，Sul1含量為7.30×107copies·mL-1。當 PO4-P 濃度為 0.05 mg·L-1時，Sul1 含量達到1.19×108copies·mL-1，高出對照實驗組1個數(shù)量級，揭示低濃度的PO4-P對Sul1含量呈顯著的促進作用（P＜0.05）；但當 PO4-P 濃度為 0.5 mg·L-1時，Sul1 含量為 7.56×107copies·mL-1，與對照組相比差異不顯著（P=0.403）；而 PO4-P 濃度為 1 mg·L-1時，Sul1含量僅為 5.15×107copies·mL-1，被顯著抑制（P＜0.05）。

氮和磷都是水環(huán)境中的營養(yǎng)元素，本研究考察了總氨氮和活性磷酸鹽對Sul1含量的影響，研究結果顯示低濃度的氮、磷對目的基因的含量變化呈促進作用，而高濃度則呈現(xiàn)顯著的抑制作用。Guo等[18]研究結果表明，與缺乏氮或磷條件相比，當?shù)?、磷和葡萄糖同時存在時，細菌ARGs接合轉移的轉化效率提高近2倍，而與僅存葡萄糖相比，轉化效率提高近100倍，實驗結果進一步證明氮、磷的存在對ARGs在環(huán)境中的遷移和轉化有顯著的影響。

3 結論

水環(huán)境因子對水中磺胺類抗性基因Sul1的存在及分布可能產(chǎn)生極其重要的影響，pH 3～5、pH 9～10、高鹽度（25～45）、高HA濃度和高氮磷濃度對Sul1含量均呈顯著的抑制作用，低濃度氮磷對Sul1含量起促進作用。

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