張 松 ，侯 彬 ，紀(jì)婷婷 ，劉 陽 ，黃 飛 ，秦梓菲 ，盧 靜 *

（1.中北大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，太原 030051；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642）

多環(huán)芳烴（PAHs）是一種廣泛存在的環(huán)境污染物，主要來源于有機(jī)材料的不完全燃燒[1]，其本身具有的半揮發(fā)性、低溶解性、難生物降解性使得其不易被去除[2]。根據(jù)苯環(huán)數(shù)量的不同，多環(huán)芳烴可以分為低環(huán)芳烴和高環(huán)芳烴，高環(huán)芳烴由于穩(wěn)定性和疏水性強(qiáng)，比低環(huán)芳烴具有更持久性[3]，而環(huán)境中存在的能夠以高分子量多環(huán)芳烴作為唯一碳源的微生物較少[4]，尋求高效修復(fù)高環(huán)芳烴的方法引起了國內(nèi)外學(xué)者的重視。芘作為一種四環(huán)多環(huán)芳烴，常被選為研究高環(huán)芳烴降解的模型化合物。

使用微生物修復(fù)環(huán)境中的多環(huán)芳烴被證明是最經(jīng)濟(jì)環(huán)保的[5]，但傳統(tǒng)的微生物修復(fù)存在生物可利用性低、容易受環(huán)境影響、與土著菌存在競爭等問題[6]。固定化微生物作為一種綠色高效的修復(fù)方法，具有保護(hù)微生物、可重復(fù)使用、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[7]，與傳統(tǒng)生物修復(fù)相比效率更高[8]。近年來，固定化微生物技術(shù)在修復(fù)有毒化合物如原油[9]、苯酚[10]、蒽[11]、熒蒽[12]、多氯聯(lián)苯[13]等方面有著廣泛的應(yīng)用。

微生物的固定化可以通過很多方式來實(shí)現(xiàn)，如吸附法、包埋法、交聯(lián)法和共價結(jié)合法，為了提高固定化顆粒的性質(zhì)，同時使污染物去除率更高，目前許多研究采用添加吸附劑而成的吸附-包埋-交聯(lián)的復(fù)合式固定化方法[6]。其中用作吸附固定化載體的材料多種多樣，如天然吸附基質(zhì)[14]、農(nóng)作物秸稈[9]、蜂窩煤渣[15]，生物質(zhì)炭是近年來發(fā)展起來的一種吸附劑，它是缺氧條件下，生物質(zhì)經(jīng)高溫?zé)峤獾漠a(chǎn)物，是一類富含碳的材料，具有較大的比表面積和豐富的孔隙結(jié)構(gòu)，并且制備生物質(zhì)炭的原材料來源廣泛[16-18]。研究表明生物質(zhì)炭是一種很有潛力的固定化材料，添加生物質(zhì)炭可以促進(jìn)受污染土壤的生物修復(fù)[19-21]。然而對生物質(zhì)炭的研究多集中于將生物質(zhì)炭直接添加于土壤促進(jìn)受污染土壤的生物修復(fù)[22-23]，本實(shí)驗(yàn)選擇將生物質(zhì)炭固定化融合菌株用于對芘的去除。

F14是以菲降解菌GY2B和芘降解菌GP3A為親本，通過原生質(zhì)體技術(shù)構(gòu)建而成的一株可以高效降解多環(huán)芳烴的融合菌株。F14對三環(huán)的菲具有比親本GY2B更高的降解能力（12 h對初始濃度為100 mg·L-1菲的降解率為99%），但是對四環(huán)的芘的降解能力較低（10 d對初始濃度為100 mg·L-1芘的降解率僅有18%）[24-25]。為了提高融合菌株F14對芘的去除效果，以便于后續(xù)在實(shí)際土壤中的應(yīng)用，本研究以不同溫度下玉米秸稈制得的生物質(zhì)炭為固定化材料，并添加聚乙烯醇和海藻酸鈉，對融合菌株F14進(jìn)行固定化，比較了添加不同溫度制備的生物質(zhì)炭的固定化小球的性質(zhì)，并探究了將固定化小球用于去除芘的效果及降解動力學(xué)，旨在為固定化微生物技術(shù)高效修復(fù)環(huán)境中的芘提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

芘購自西格瑪公司，純度為98%；聚乙烯醇（PVA）、無水氯化鈣、亞甲基藍(lán)均購自天津光復(fù)試劑有限公司；海藻酸鈉（SA）和無水硫酸鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硼酸和正己烷購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；營養(yǎng)肉湯購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

將無水硫酸鈉于馬弗爐中400℃灼燒4 h后放入干燥器內(nèi)備用，正己烷重蒸后使用，醫(yī)用脫脂棉用二氯甲烷抽提72 h，通風(fēng)櫥風(fēng)干后放入干燥器內(nèi)備用。

UV-6000PC型紫外-可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；Ultimate高效液相色譜儀（Thermo Scientific）；TriStar 3020 II型物理吸附儀（美國 Micromeritics公司）；1027HT型超聲波清洗器（深圳市潔拓超聲波清洗設(shè)備有限公司）；RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鄭州特爾儀器設(shè)備有限公司）；HC-3018高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；水浴恒溫振蕩器（天津市歐諾儀器儀表有限公司）；恒溫振蕩器（太倉華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)液（MSM）[26]：分別取5 mL磷酸鹽緩沖液（KH2PO48.5 g·L-1、K2HPO4·H2O 21.75 g·L-1、Na2HPO4·12H2O 33.4 g·L-1、NH4Cl 5.0 g·L-1）；3 mL MgSO4水溶液（22.5 g·L-1）；1 mL CaCl2水溶液（36.4 g·L-1）；1 mL FeCl3水溶液（0.25 g·L-1）；1 mL 微量元素（MnSO4·H2O 39.9 mg·L-1、ZnSO4·H2O 42.8 mg·L-1、（NH4）6Mo7O24·4H2O 34.7 mg·L-1），定容至 1 L，并將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)為6.8～7.0。

本實(shí)驗(yàn)過程中所用到的玻璃器皿和溶液均在121℃下高壓蒸汽滅菌30 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 融合菌株F14的復(fù)壯

將融合菌株F14加入營養(yǎng)肉湯中，32℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)，24 h后將營養(yǎng)肉湯菌液離心10 min（6000 r·min-1），菌體用磷酸鹽緩沖液清洗3次并重新溶解于磷酸鹽緩沖液中，最終制得一定濃度的菌懸液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 生物質(zhì)炭的制備

將玉米秸稈烘干粉碎后填滿于密閉的熱解盒中，放入馬弗爐中通10～20 min氮?dú)?，分別在300、500℃和700℃3種溫度下熱解2 h，冷卻至室溫后取出研磨過60目篩，儲存于干燥器中備用。

1.3.3 固定化材料比例的優(yōu)化

PVA和SA的混合載體機(jī)械強(qiáng)度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、傳質(zhì)性能較好，但是PVA和SA的濃度，以及二者的比例都會對固定化小球的性能造成很大影響。為了確定PVA和SA的最佳組合比例，選取PVA濃度為6%、8%和10%，SA濃度為 0.3%、0.5%和 1%進(jìn)行研究。

將不同濃度的PVA溶液和SA溶液分別于90℃水浴振蕩器和60℃水浴鍋中溶解，一段時間后將二者60℃混合于水浴振蕩器中繼續(xù)溶解，待溶液混合均勻停止溶解。當(dāng)混合液降至室溫，與滴入4%飽和硼酸的CaCl2水溶液交聯(lián)6 h，觀察交聯(lián)過程中小球的成球效果，同時測定交聯(lián)完成后小球的性能，以此來確定PVA和SA的最佳比例。

1.3.4 固定化微生物小球的制備

在上述確定的最優(yōu)PVA和SA條件下制備生物質(zhì)炭固定化小球：將300℃制備的一定量生物質(zhì)炭加入菌懸液中混合均勻，并與溶解好的PVA和SA的混合液進(jìn)行混合，室溫下靜置。一段時間后與滴入4%飽和硼酸的CaCl2水溶液交聯(lián)30 min，然后將形成的小球轉(zhuǎn)移至1 mol·L-1的無水硫酸鈉溶液繼續(xù)交聯(lián)6 h。交聯(lián)完成后用生理鹽水洗滌3次備用。分別用500℃和700℃制備的生物質(zhì)炭重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，并測定各條件下小球的性能。

1.3.5 固定化小球性能的測定

直徑：用游標(biāo)卡尺測量不同條件下制備的固定化小球的直徑，每組小球測30顆，求平均值。

機(jī)械強(qiáng)度：將固定化小球浸泡在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，放于搖床上振蕩，10 d后觀察小球的破碎程度。

膨脹系數(shù)：測定固定化小球在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中振蕩10 d后小球的直徑，測得的平均直徑與原小球直徑之比即為膨脹系數(shù)。

傳質(zhì)性能：配制2%的亞甲基藍(lán)乙醇溶液（亞甲基藍(lán)溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用）。滴加配好的亞甲基藍(lán)乙醇溶液30滴于500 mL蒸餾水中，混合均勻后用于小球傳質(zhì)性能的測定。取此溶液分別加入固定化小球50顆放于搖床上振蕩，24 h后在波長665 nm下，分別測定放小球的亞甲基藍(lán)溶液的吸光度和原亞甲基藍(lán)溶液的吸光度，比較測得的吸光度值大小，通過吸光度值的變化可間接反映固定化小球傳質(zhì)性能的好壞。

1.3.6 比表面積（BET）的測定

將不同條件下制備的固定化小球進(jìn)行冷凍干燥，利用TriStar 3020 II型物理吸附儀進(jìn)行液氮吸附脫附實(shí)驗(yàn)，測定小球的比表面積和孔徑。

1.3.7 掃描電鏡分析（SEM）

利用掃描電鏡觀察不同條件制備的小球的表面結(jié)構(gòu)。首先將各種方法制備的小球用磷酸鹽緩沖液清洗3次，然后在2.5%的戊二醛溶液中（4℃）固定化12 h以上，用不同濃度的乙醇溶液脫水后進(jìn)行真空冷凍干燥，并濺射鍍金膜，預(yù)處理完成的樣品被切開放置在JEOL JEM6490LV掃描電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.8 固定化小球?qū)诺娜コ?/p>

將制備好的固定化小球加入初始濃度為50 mg·L-1的含芘無機(jī)鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)9個周期，每個周期10 d，測定其剩余芘濃度，并在一個周期后與游離菌進(jìn)行比較。由于實(shí)驗(yàn)過程中所用的芘濃度均大于芘在水中的溶解度（0.135 mg·L-1左右），因此芘的不溶性晶體在溶液中的分布是不均勻的，萃取時必須整瓶萃取。具體步驟為：（1）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別向錐形瓶中加入10 mL正己烷超聲萃取15 min，倒入分液漏斗，棄去水相收集有機(jī)相，該過程重復(fù)2次；（2）將收集的有機(jī)相過無水硫酸鈉；（3）放于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至1～2 mL；（4）定容到一定體積，用高效液相色譜儀進(jìn)行測定。使用后的固定化小球用生理鹽水沖洗回收，重復(fù)使用。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化材料的最佳結(jié)合比例

將PVA和SA按不同比例組合后，對制備的固定化小球的性質(zhì)進(jìn)行了測試。根據(jù)交聯(lián)過程中小球的成球效果，初步篩選出4組成球較好的小球，分別是6%PVA+1%SA、8%PVA+0.5%SA、8%PVA+1%SA 和10%PVA+0.5%SA。對這4組小球的傳質(zhì)性能和機(jī)械性能進(jìn)行測試，結(jié)果如表1所示。4組小球在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中浸泡后都沒有破碎，其中8%PVA+1%SA和10%PVA+0.5%SA傳質(zhì)性能最好，綜合考慮小球的成球效果、傳質(zhì)性能和機(jī)械強(qiáng)度確定8%PVA+1%SA為最佳比例，在此條件下制得的固定化小球呈規(guī)則球形，大小均勻，如圖1所示。

表1 不同固定化材料比例小球的性能Table 1 Performance of immobilized microbial beads

圖1 固定化微生物小球外觀效果Figure 1 The appearance images of the immobilized microorganism beads

2.2 不同生物質(zhì)炭制備的固定化小球的性能分析

無生物質(zhì)炭和不同溫度下制備的生物質(zhì)炭的固定化小球的直徑、機(jī)械性能和傳質(zhì)性能如表2所示。由表2可以看出，所有條件下制備的小球的直徑無明顯差別，大約為3 mm左右。這比Huang等[27]用煤渣包埋芘和苯并芘降解菌制備的小球的直徑（6～8 mm）明顯低。而有研究表明，粒徑越小降解率越高[28]。同時，所有固定化小球均能保持良好的機(jī)械性能，即在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中振蕩10 d后沒有任何破碎，滿足了小球在生物處理廢水中需要的高穩(wěn)定性[29]。可以發(fā)現(xiàn)，在加入生物質(zhì)炭后，小球的膨脹系數(shù)有了略微的下降，而膨脹系數(shù)越低，小球的穩(wěn)定性越好[30]。與不添加生物質(zhì)炭的小球相比，添加生物質(zhì)炭制備的固定化小球傳質(zhì)性能明顯提高，其中700℃制備的生物質(zhì)炭效果最好。

表2 固定化微生物小球的性能Table 2 Performance of immobilized microbial beads

2.3 不同生物質(zhì)炭制備的固定化小球的表面形態(tài)及孔結(jié)構(gòu)分析

分別對不同固定化小球的表面性質(zhì)和孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行了考察，結(jié)果如表3所示。添加生物質(zhì)炭后小球的比表面積都有不同程度的提高，其中添加700℃生物質(zhì)炭制備的小球比表面積最大，孔徑最小，有利于微生物和載體基質(zhì)的接觸，同時對有機(jī)物也有較好的吸附性能，進(jìn)而提高了微生物對有機(jī)物的去除率。

小球的SEM圖如圖2所示，很明顯可以發(fā)現(xiàn)添加生物質(zhì)炭的小球表面比不添加生物質(zhì)炭的小球更粗糙，更有利于微生物的吸附。結(jié)合表3的比表面積和圖2的微觀結(jié)構(gòu)圖可以得出700℃生物質(zhì)炭表面凹凸不平、比表面積最大，有利于吸附。因此，在接下來的實(shí)驗(yàn)選擇700℃生物質(zhì)炭做進(jìn)一步研究。

2.4 芘去除效果的研究

2.4.1 游離菌和固定化菌對芘的去除

實(shí)驗(yàn)研究了游離菌、固定化菌和不含微生物的生物質(zhì)炭空白小球?qū)Τ跏紳舛葹?0 mg·L-1芘的去除，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，固定化菌對芘的去除明顯高于游離菌，游離菌對芘的去除率只有37.38%，而固定化菌的去除效率最高可達(dá)到94.91%。這可能是由于固定化載體可以為微生物的生長提供更好的場所，同時能夠使細(xì)胞保持更高的活性。比較固定化菌和空白小球?qū)诺娜コ?，可以看出空白小球?qū)啪哂形阶饔?，且吸附在小球上的芘可以被F14降解，因此推測固定化小球?qū)诺娜コ且揽课胶蜕锝到獾膮f(xié)同作用。除此之外，為了評估瓶壁和細(xì)胞對芘的吸附作用，設(shè)置控制組實(shí)驗(yàn)研究無細(xì)胞和滅活細(xì)胞對初始濃度為50 mg·L-1芘的去除，結(jié)果表明芘的消耗僅有4.60%和6.03%，可以忽略不計。

表3 固定化微生物小球的比表面積和孔結(jié)構(gòu)Table 3 Special surface area and porosity of immobilized microbial beads

圖3 芘降解曲線Figure 3 Curves of pyrene degradation

2.4.2 融合菌株F14降解芘的動力學(xué)方程

為了更好地研究游離菌和固定化菌對芘的降解，本實(shí)驗(yàn)將游離菌和固定化菌分別投加到初始濃度為50 mg·L-1的含芘無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，通過測定不同降解時間下芘的濃度，計算游離菌和固定化菌對芘的降解動力學(xué)。Monod方程是歷史上首先提出并且被廣泛接受的動力學(xué)方程[31]。其中底物降解速度與底物濃度之間的關(guān)系式為：

式中：v為底物降解速度；c為底物濃度；Ks為飽和常數(shù)，又稱半速度常數(shù)。

當(dāng)c＞＞Ks時，降解過程遵循零級反應(yīng)動力學(xué)，底物與時間的關(guān)系式為：

當(dāng)c＜＜Ks時，降解過程遵循一級反應(yīng)動力學(xué)，底物與時間的關(guān)系式為：

式中：c為底物濃度；t為降解時間；k0和k1分別為零級和一級降解動力學(xué)降解速度常數(shù)；a和b為常數(shù)。

對游離菌和固定化菌對芘降解的數(shù)據(jù)分別按一級反應(yīng)和零級反應(yīng)方程形式擬合，線性擬合得出，其降解曲線均符合一級動力學(xué)模型，其中動力學(xué)方程、模型參數(shù)k及半衰期結(jié)果如表4所示。由表可以看出，固定化菌對芘的降解速率明顯高于游離菌。

表4 游離菌和固定化菌對芘降解的一級動力學(xué)模型參數(shù)Table 4 Parameters and statistical indexes of the first-order kinetic model for pyrene degradation by free cells and immobilized microbial beads

2.4.3 固定化小球用于去除芘的使用次數(shù)

小球9個周期的10 d去除率重復(fù)率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，前8個周期小球的去除率下降得非常緩慢，前8個周期去除率能達(dá)到80%以上，說明小球去除效果較好，可以重復(fù)使用。8個周期后小球的去除效率急劇下降，可能由于前8個周期的使用，使小球內(nèi)降解菌的活性下降，載體材料的吸附性下降，吸水后小球內(nèi)部空隙率變小等原因?qū)е隆?/p>

圖4 固定化小球重復(fù)使用率Figure 4 Repeated times of immobilized beads

3 結(jié)論

（1）研究以由菲降解菌GY2B和芘降解菌GP3A融合而成的菌株F14為微生物進(jìn)行固定化，確定了載體PVA和SA的最佳組合比例為8%和1%。

（2）以300、500℃和700℃制備的生物質(zhì)炭為吸附劑，采用“吸附-包埋-交聯(lián)”的復(fù)合式固定化方法制備固定化微生物小球，并比較了固定化小球的性能，其中700℃制備的生物質(zhì)炭的固定化小球性能較好。

（3）與游離菌相比，固定化菌對芘的去除效率明顯較高，且符合一級反應(yīng)動力學(xué)規(guī)律；而固定化小球可以重復(fù)使用高達(dá)9次。

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