劉錦嫦 ，熊雙蓮 ，3*，馬 爍 ，高 菲 ，涂書新 ，3

（1.華中農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，武漢 430070；2.華中農業(yè)大學微量元素研究中心，武漢 430070；3.土壤環(huán)境與污染修復湖北省重點實驗室，武漢 430070）

硒（Se）是人和動物必需的營養(yǎng)元素，世界上大約有10億的人口缺硒，中國約72%的土地缺硒[1]。谷物及其產品是人體攝入硒的主要來源之一，通過施用外源硒肥生產富硒大米是解決人體缺硒的有效措施[2]。硒亦為植物生長的有益元素，適量硒可以提高植物抵抗逆境脅迫的能力，降低植物對重金屬的吸收累積[3-4]。

砷（As）是環(huán)境中普遍存在的一種毒性較強的致癌物質，對動植物均具有毒害作用。水稻是我國主要的糧食作物之一，較其他谷物具有更強的吸收累積砷的能力[5]。我國南方一些礦區(qū)周邊稻田中存在不同程度的土壤砷污染[6-8]。有調查表明砷污染稻田稻米中硒含量與砷含量呈負相關[9]；將富硒土壤上生長的芥菜施入到土壤中降低了水稻植株及稻米中砷的含量，但對稻米硒含量的影響不清楚[10]。關于水稻硒砷交互作用對水稻砷和硒吸收累積的影響已有少量報道[11-12]，但砷或硒處理濃度比較單一、研究結論不一致[12-13]。例如 Hu 等[13]研究了 1 μmol·L-1硒與 1 μmol·L-1砷的交互作用，表明硒或砷處理僅降低水稻地上部砷或硒含量，對根中兩元素含量有促進作用；而Kumar等[12]對25 μmol·L-1硒和 25 μmol·L-1砷交互作用的研究則表明硒降低水稻根和地上部砷的含量，砷則提高根和地上部硒的含量。硒對植物生長表現(xiàn)出雙重作用，即低濃度促進、高濃度抑制[14]。目前雖有研究探討了硒緩解水稻砷毒害的機理[12，15]，但均是在高砷（25 μmol·L-1）和高硒（25 μmol·L-1）條件下，如此高的硒水平在單獨施用時已對作物產生了毒害[12]，在實際生產中并不可取。因此系統(tǒng)研究不同濃度的硒與砷交互作用對水稻生長和砷、硒累積的影響及機理對于水稻富硒、降砷有十分重要的意義。

淹水條件下，土壤中砷和硒主要以三價砷和四價硒的形態(tài)存在[16]。本文系統(tǒng)研究了不同水平的三價砷和四價硒處理條件下，硒和砷單獨及聯(lián)合處理對水稻幼苗砷和硒累積及抗氧化系統(tǒng)的影響，探討硒砷相互作用的機理，旨在為水稻降砷、富硒提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料及幼苗培養(yǎng)

供試水稻品種為廣兩優(yōu)272，由湖北省農業(yè)科學院糧食作物研究所選育。水稻種子經消毒（10%過氧化氫）、清洗、浸泡、萌發(fā)后，置于可控光培養(yǎng)室培育5 d，其培養(yǎng)液用1/4國際水稻研究所（IRRI）推薦的配方營養(yǎng)液。選擇長勢一致的水稻幼苗移栽到塑料盒中（規(guī)格28 cm×20 cm×8 cm），每盒移植48株水稻幼苗，用100%水稻營養(yǎng)液培育10 d。用KOH和HCl調節(jié)pH為5.5～6.0。可控光生長室條件：14 h的光照（260～350 μmol·m-2·s-1），白天溫度為 28 ℃，夜間為 20 ℃，相對濕度為60%～70%。

1.2 試驗方法

考慮生產實際中硒的施用濃度不宜過高，硒的試驗濃度設計原則為單獨處理時對作物生長不產生毒害作用。砷的試驗濃度設計則考慮了低砷水平（不產生毒害作用）和高砷水平（產生明顯毒害作用）。在參考文獻[12]和[15]并進行預備試驗的基礎上，本研究砷濃度設為 0、5、25 μmol·L-1As（NaAsO2），硒濃度設為 0、1、5、10 μmol·L-1Se（Na2SeO3），采用隨機完全區(qū)組設計，共 12 個處理，分別用 CK、As5、As25、Se1、Se5、Se10、As5Se1、As5Se5、As5Se10、As25Se1、As25Se5、As25Se10表示，每處理3次重復。選擇生長一致的幼苗進行砷和硒處理，期間每周更換2次營養(yǎng)液，處理2周后進行收獲。水稻幼苗先用自來水沖洗，再用去離水沖洗3遍，將地上部與根部剪開，分別測量根部和地上部鮮重。然后將根和葉片平均分成兩份，取一份根和葉片放在-80℃超低溫冰箱保存，用于測定抗氧化系統(tǒng)等指標，另一份樣品在105℃殺青15 min，70℃烘干、研磨后，用于測定砷和硒的含量，并計算轉運系數(shù)（水稻地上部As或Se含量與根中As或Se含量的比值）。

1.3 測定方法

砷和硒含量測定：植物樣品經硝酸-高氯酸（4∶1）消解后，用原子熒光光度計（AFS8220，北京吉天儀器公司，中國）檢測[17]。采用標準物質灌木枝葉GBW 07602（GSV-1）進行分析質量控制。

超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑（NBT）光還原比色法，過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法，過氧化氫酶（CAT）活性測定采用過氧化氫分解法，丙二醛（MDA）含量測定采用TBA比色法[18]。谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性測定參考黃愛纓等[19]的方法。谷胱甘肽（GSH）、非蛋白巰基物質（NPT）及植物絡合素（PCs）含量測定采用比色法[20]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Genstat 18th Edition統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行雙因素方差分析及多重比較。采用Sigma Plot 10.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 硒砷交互作用對水稻幼苗生長的影響

圖1結果表明砷處理顯著影響了水稻的生長（P＜0.05），表現(xiàn)為低濃度促進、高濃度抑制：As5處理地上部和根部鮮重分別較對照增加了3.1%和10.8%，As25處理較對照分別降低了4.8%和8.3%。低濃度硒處理顯著促進了水稻幼苗的生長（P＜0.05）：Se1處理地上部和根部鮮重分別比對照增加了11.9%和27.8%，Se5則分別增加了9.5%和25%（圖1）。

砷和硒對水稻根部（P＜0.01）和地上部（P＜0.01）鮮重的影響有顯著交互作用。低濃度砷處理（5 μmol·L-1）條件下，≤5 μmol·L-1低硒處理對水稻幼苗生長有協(xié)同促進作用，其地上部和根部鮮重約是不加硒處理的 1.05～1.18 倍。高濃度砷處理（25 μmol·L-1）條件下地上部和根部鮮重隨著硒處理濃度增加而升高，到10 μmol·L-1硒處理時達到最大值，是不加硒處理的1.09倍和1.12倍，由此說明高硒處理可以拮抗高砷脅迫對水稻生長的抑制作用。

2.2 硒砷交互作用對水稻幼苗砷和硒吸收累積的影響

圖2A、圖2B結果表明，除As25Se1處理外，添加硒處理顯著降低了地上部和根部砷含量（P＜0.05），由此說明適宜濃度的硒對水稻砷吸收存在拮抗作用。水稻地上部和根部砷含量As5Se1、As5Se5、As5Se10處理分別是 As5處理的 69.3%、49.4%、52.7%和81.8%、84.1%、72.5%；As25Se10處理分別是 As25處理的79.1%和86.3%（圖2A、圖2B）。添加硒使低砷和高砷處理水稻砷的轉運系數(shù)由0.041和0.062分別降至0.024～0.034和0.053～0.057，由此說明硒處理抑制了砷向地上部的轉運。

砷處理對水稻地上部硒的含量產生了拮抗作用（圖 2C、圖 2D）。低砷（5 μmol·L-1As）和高砷（25 μmol·L-1As）處理水稻地上部硒的含量僅分別為不加砷處理的35.8%～65.3%和17.2%～44.3%（圖2C）。與地上部不同，水稻根部硒的含量則是隨著砷濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢：低砷（5 μmol·L-1As）處理水稻根部硒含量為不加砷處理的1.16～1.77倍，高砷（25 μmol·L-1As）處理則為不加砷處理的 63.2%～74.1%（圖2D）。砷處理同樣抑制了硒向水稻地上部的轉移：Se1、Se5和Se10處理水稻硒的轉運系數(shù)分別為0.30、0.25和0.28，添加砷處理分別為不加砷處理的25%～30%、26%～42%和36%～60%。

2.3 硒砷交互作用對水稻幼苗抗氧化系統(tǒng)及巰基化合物含量的影響

圖3結果表明單獨砷處理條件下，低濃度砷（5 μmol·L-1）處理對水稻抗氧化酶活性和MDA含量均無顯著影響（P＞0.05）；高濃度砷（25 μmol·L-1）處理則顯著提高了水稻葉片和根中SOD酶、POD酶活性及MDA含量（P＜0.05），分別是不加砷處理的1.32倍和1.18倍（圖 3A、圖 3B）、2.23倍和 1.17倍（圖 3C、圖3D）及1.71倍和1.87倍（圖3E、圖3F）。

圖1 砷和硒處理14 d水稻幼苗地上部（A）和根部（B）鮮重Figure 1 The fresh weight of shoots（A）and roots（B）of rice seedlings treated with different level of As and Se for 14 d

圖2 砷和硒處理14 d水稻幼苗地上部和根部砷（A、B）和硒（C、D）的含量Figure 2 The As（A，B）and Se（C，D）content in shoots and roots of rice seedlings treated with different level of As and Se for 14 d

硒和砷處理對水稻幼苗抗氧化酶活性和MDA含量產生了顯著的交互作用。同一砷水平下，硒處理顯著提高了水稻幼苗葉和根中GPx活性，且葉中GPx活性隨著硒處理濃度增加而升高；砷與硒交互作用對水稻根部和葉片中GPx活性具有顯著的協(xié)同促進作用（P＜0.05）（圖 3G、圖 3H）。低砷條件下，硒顯著降低了葉中MDA含量（圖3I），但對根中MDA含量無顯著影響（圖3J）。高砷條件下，硒處理降低了水稻葉片和根中SOD酶活性，約為不加硒處理的70%～89%（圖3A、圖3B）；水稻葉和根中POD酶活性隨著硒處理濃度的增加先降低后增高，在Se10時達到最大值，顯著高于無Se和低Se處理（圖3C、圖3D）。添加硒亦顯著降低高砷處理水稻葉片和根中MDA含量，且隨著硒處理濃度的增加MDA含量逐漸降低。As25Se1、As25Se5、As25Se10 處理葉片和根中 MDA含量分別是As25處理的64.7%、54.7%、43.6%（圖3I）和 75.1%、72.1%、58.4%（圖 3J）。

圖 3 砷和硒處理 14 d水稻幼苗葉（A、C、E、G、I）和根（B、D、F、H、J）中 SOD、POD、CAT、GPx酶活性及 MDA 含量Figure 3 The activities of SOD，POD，CAT and GPx as well as the content of MDA in leaves（A，C，E，G，I）and roots（B，D，F(xiàn)，H，J）of rice seedlings treated with different level of As and Se for 14 d

圖4結果表明，單獨砷處理顯著增加了水稻根中GSH、NPT、PCs及葉中 GSH 的含量（P＜0.05），但對葉中NPT和PCs含量無顯著影響（P＞0.05）。低砷處理（5 μmol·L-1）下，加硒降低了水稻葉片 GSH 含量、但對根部無顯著影響；高砷處理（25 μmol·L-1）下，水稻葉和根部GSH含量隨著硒處理濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，在Se5達到最大值（圖4A，圖4B）。水稻根中NPT和PCs含量在低砷條件下隨著硒處理濃度的增加而降低，高砷條件下則隨著硒濃度的增加呈先降低后升高趨勢，在10 μmol·L-1硒處理時達到最大值（圖 4D，圖 4F）。

3 討論

三價砷和四價硒均可通過硅轉運蛋白OsNIP2；1進入水稻植株[21-22]，因此理論上硒和砷交互對水稻砷和硒的累積存在拮抗作用。我們的結果也證實適量的硒或砷可以拮抗水稻對砷或硒的吸收和轉運，且砷處理濃度越高，產生顯著抑制作用所需硒的濃度亦越高（圖 2）。Chauhan 等[15]研究表明 25 μmol·L-1As處理條件下 5～20 μmol·L-1Se處理顯著抑制了水稻對砷的吸收，本研究的結果（≥5 μmol·L-1Se）與其相類似。

圖 4 砷和硒處理14 d水稻幼苗葉（A、C、E）和根（B、D、F）GSH、NPT和 PCs含量Figure4 TheGSH，NPTandPCscontentinleaves（A，C，E）androots（B，D，F(xiàn)）ofriceseedlingstreatedwithdifferentlevelofAsandSefor14d

砷處理抑制水稻地上部的硒含量，但低濃度砷（5 μmol·L-1As）處理顯著增加幼苗根部硒的含量（圖2），這一結果與 Hu 等[13]1 μmol·L-1As處理的研究結果相類似，其原因可能是一方面四價硒除了利用硅轉運蛋白OsNIP2；1外，還可以通過磷酸轉運體被植物吸收[23]，導致低濃度砷對水稻吸收硒的抑制作用有限；另一方面低砷處理顯著促進了根系生長（圖1），從而可能提高了根對硒的吸收能力。四價硒被植物吸收后通常在根部轉化為有機硒而留在根部，Hu等[13]研究發(fā)現(xiàn)砷處理提高了水稻根部SeMet的含量，這可能是導致硒在水稻幼苗根部累積及地上部降低的另一個原因。具體原因還需要從砷對硒的吸收動力學及硒轉運蛋白基因表達等方面進一步深入研究。

砷對植物生長的影響與其劑量有關。高砷處理抑制了水稻生長，對其造成了氧化脅迫、提高了細胞膜脂過氧化產物 MDA含量（圖1、圖 3）。SOD、POD、CAT及GPx是一類重要的抗氧化酶，它們在清除重金屬誘導產生的氧自由基和過氧化物、抑制膜質過氧化、保護細胞免遭傷害等方面起著重要的作用。硫醇化合物在植物緩解砷的毒害及耐受性中發(fā)揮重要作用：GSH是一種抗氧化劑，同時As（Ⅲ）與GSH、PC等多肽的巰基絡合后貯存在液泡中可以降低砷對植物的毒害作用[24-25]。Kumar等[12]研究發(fā)現(xiàn)高硒處理（25 μmol·L-1Se）提高了砷脅迫處理水稻幼苗抗壞血酸過氧化物酶（APX）、CAT和GPx的活性及GSH和PCs的含量，硒通過調節(jié)抗氧化酶活性及巰基化合物的含量來緩解砷誘導的氧化脅迫。我們的研究發(fā)現(xiàn)1～10 μmol·L-1Se處理均可顯著緩解高砷誘導的氧化脅迫，且隨硒處理濃度增加，緩解作用增強（圖3）。與Kumar等[12]研究結果稍有不同的是，高砷脅迫下，低硒處理（1～5 μmol·L-1Se）僅顯著增加了幼苗GPx活性和GSH含量，對POD和CAT酶活性及NPT和PCs含量無顯著影響。硒是GPx的成分，相關分析表明硒與葉中GPx活性有正相關（r=0.373*），由此推測加硒后水稻幼苗GPx活性的顯著增加在緩解砷誘導的氧化脅迫中發(fā)揮著重要作用。隨著硒處理濃度提高，10 μmol·L-1Se處理不僅顯著提高了GPx活性，還顯著增加了POD酶活性及NPT和PCs含量，進一步增強了抑制高砷誘導的氧化脅迫的作用，降低砷的毒害作用。

綜上所述，適量的硒可以促進水稻的生長、且硒與砷交互作用對水稻地上部砷和硒累積存在拮抗作用，因此在砷污染的農田可以考慮使用硒肥來降低砷的含量、提高硒的含量。由于本研究是在溶液培養(yǎng)條件下進行的，還需要進一步進行全生育期盆栽和大田試驗，并進行安全評估，以確定不同砷污染程度的土壤中硒肥的最佳用量，達到既可以降低稻米砷含量、提高硒含量，又不會產生負面影響（如稻米中硒含量過高）的目的。

4 結論

（1）低硒（≤5 μmol·L-1Se）和低砷（5 μmol·L-1As）交互作用對水稻生長有協(xié)同促進作用；高硒（10 μmol·L-1Se）處理可以顯著拮抗高砷（25 μmol·L-1As）脅迫對水稻生長的抑制作用。

（2）硒對水稻砷的吸收和轉運有拮抗作用，但高砷脅迫下產生顯著抑制作用所需的硒濃度相應提高；砷顯著抑制硒向水稻地上部轉運和累積，但對根部硒的含量影響表現(xiàn)為低砷促進、高砷抑制。

（3）高砷脅迫下，硒顯著抑制了水稻幼苗細胞膜的過氧化作用，且抑制作用隨著硒處理水平提高而增強；硒砷交互對水稻幼苗谷胱甘肽過氧化物酶活性有協(xié)同促進作用。

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