馮飛斐， 王一丁

(四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 610100)

中華真地鱉(EupolyphagesinensisWalker)，中藥名土鱉蟲(chóng)，別稱(chēng)土元、地鱉蟲(chóng)、地烏龜、簸箕蟲(chóng)等，為蜚蠊目鱉蠊科地鱉亞科地鱉屬昆蟲(chóng)。中華真地鱉雌蟲(chóng)干燥體是一種傳統(tǒng)中藥，是《中華人民共和國(guó)藥典》中記載的正品藥材。中華真地鱉的藥用歷史悠久，成書(shū)于漢代我國(guó)第一部藥物著作《神農(nóng)本草經(jīng)》、東漢著名醫(yī)學(xué)家張仲景的《金匱要略》以及明代李時(shí)珍的《本草綱目》等幾乎所有著名藥典都對(duì)其有明確的記載[1]。中華真地鱉腸具有破血逐淤、續(xù)筋接骨的功能，被廣泛應(yīng)用于中藥處方中。現(xiàn)代藥理學(xué)的研究表明，中華真地鱉對(duì)心腦血管系統(tǒng)有保健作用，能降脂調(diào)脂、抗凝血、抗血栓等，還具有抗腫瘤、抗氧化作用，此外還具有促進(jìn)骨折愈合、鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)人體免疫等功效[2]。還有研究發(fā)現(xiàn)，中華真地鱉營(yíng)養(yǎng)豐富，部分地區(qū)已把它加工成食品[3]。

最初，中華真地鱉主要靠野生藥源滿(mǎn)足市場(chǎng)，近年來(lái)，由于化肥、農(nóng)藥的大量使用，使其自然生存環(huán)境遭到破壞，野生藥源日益枯竭，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿(mǎn)足不了國(guó)內(nèi)市場(chǎng)和出口創(chuàng)匯的需要[4]，而人工飼養(yǎng)地鱉蟲(chóng)，不需要特殊設(shè)備，可因陋就簡(jiǎn)，投資少[5]。因此，人工飼養(yǎng)中華真地鱉很快成為各地開(kāi)展經(jīng)營(yíng)的項(xiàng)目。到目前為止，我國(guó)中華真地鱉規(guī)?；B(yǎng)殖已有三十多年歷史[6]。在影響中華真地鱉生命活動(dòng)的各種不同因素中，人們對(duì)溫度、濕度、光照度、食物等外界因素的關(guān)注較多，但對(duì)中華真地鱉腸道微生物的研究與闡述較少。昆蟲(chóng)腸道系統(tǒng)是隨著取食、消化、排泄等活動(dòng)而多變的環(huán)境，其中寄居的微生物與昆蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)生理活動(dòng)有著密切的關(guān)系，一方面其群落結(jié)構(gòu)、代謝活動(dòng)受到昆蟲(chóng)腸道微環(huán)境的影響，另一方面它們也影響著昆蟲(chóng)的生命活動(dòng)[7]。近年來(lái)，對(duì)一些重要昆蟲(chóng)的腸道微生物的研究日漸活躍。同為蜚蠊目的美洲大蠊、德國(guó)小蠊作為對(duì)人類(lèi)危害較大的害蟲(chóng)，其腸道微生物也受到了研究人員的關(guān)注[8-9]。目前，中華真地鱉產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)正在不斷深入。為了深入研究中華真地鱉的營(yíng)養(yǎng)生理狀況，人為控制或改良中華真地鱉腸道微生態(tài)環(huán)境，開(kāi)發(fā)中華真地鱉腸道微生物資源，研制微生態(tài)制劑，降低中華真地鱉人工繁育生產(chǎn)成本，筆者對(duì)中華真地鱉的腸道細(xì)菌進(jìn)行了初步研究。

本研究采用基于Illumina Hiseq 2500平臺(tái)的第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)中華真地鱉腸道微生物種類(lèi)組成進(jìn)行分析，該方法相較于傳統(tǒng)分析技術(shù)能夠產(chǎn)生覆蓋深度更大的數(shù)據(jù)量，檢測(cè)到純培養(yǎng)和傳統(tǒng)非培養(yǎng)技術(shù)未能發(fā)現(xiàn)的低豐度腸道微生物種類(lèi)。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)源

雌性中華真地鱉成蟲(chóng)，購(gòu)于山東省臨沂市蒙山中華真地鱉養(yǎng)殖中心。

1.2 樣品消毒

取3頭健康的中華真地鱉雌性成蟲(chóng)，用無(wú)菌水沖洗干凈后用75%乙醇浸泡3 min，再用無(wú)菌水沖洗3次，然后在蠟盤(pán)中進(jìn)行無(wú)菌解剖，去除殘留脂肪體后，取出其腸道內(nèi)容物備用。

1.3 腸道總DNA的提取

使用TIANamp Stool DNA Kit提取中華真地鱉腸道內(nèi)容物總DNA，將提取出來(lái)的DNA樣品放在-70 ℃冰箱中保存。

1.4 16S rDNA-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增

以中華真地鱉腸道內(nèi)容物總DNA為模板，使用16S rDNA-V4區(qū)特異引物515F(5′-GTGCCAGCMCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，及TIANGEN 2×TaqPCR Master Mix進(jìn)行PCR。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.5 文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

確定PCR產(chǎn)物濃度達(dá)到上機(jī)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)后。將3個(gè)樣品送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司測(cè)序。先分別用帶不同條碼(bar-code)的16S rDNA-V4區(qū)特異引物515F、806R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以區(qū)分樣品。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，用Qiagen Gel Extraction Kit回收目的條帶，再進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。文庫(kù)構(gòu)建采用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit，質(zhì)控合格后上機(jī)測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq 2500。

1.6 生物信息學(xué)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)FLASH軟件拼接，QIIME軟件過(guò)濾，UCHIME Algorithm軟件去除嵌合體后得到有效數(shù)據(jù)[10-12]。再用UPARSE軟件對(duì)有效數(shù)據(jù)在97%水平上進(jìn)行操作分類(lèi)單元(operational taxonomic unit，簡(jiǎn)稱(chēng)OTU)聚類(lèi)，并用基于GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)的RDP Classifier分類(lèi)工具進(jìn)行物種注釋[13-14]。用QIIME軟件計(jì)算每個(gè)樣品的Alpha多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列數(shù)與OTU數(shù)量統(tǒng)計(jì)

3個(gè)樣本 Y1、Y2、Y3中的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)分析處理，剔除蟑螂桿狀體屬(Blattabacterium)序列后，分別得到67 831、70 231、42 050條有效序列。對(duì)3個(gè)樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化(data normalization)后，每個(gè)樣本均含42 050條有效序列，為統(tǒng)計(jì)方便，此后提到的有效序列均為標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)。按照16S rDNA相似性≥97%為一個(gè)OTU分類(lèi)單元，Y1、Y2、Y3這3個(gè)樣本分別含有1 765、1 852、1 602個(gè)OTU，其中1 437個(gè)OTU在3個(gè)樣本中都有發(fā)現(xiàn)。

2.2 腸道菌群的α多樣性

如圖1所示，3個(gè)樣本的稀釋曲線(xiàn)斜率隨著測(cè)序通量的增大而逐漸降低，趨于平坦。采用Shannon、Simpson 、Chao1、ACE等指數(shù)來(lái)表示樣品中微生物的α多樣性，如表1所示，3個(gè)樣本的覆蓋率(Good’s coverage)都較高，達(dá)到了99.0%～99.7%。以上結(jié)果說(shuō)明，測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，樣本中的絕大多數(shù)菌都被檢出。3個(gè)樣本的α多樣性隨個(gè)體的不同而有所變化。

表1 3份中華真地鱉腸道內(nèi)容物樣本的多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 中華真地鱉腸道菌群結(jié)構(gòu)

2.3.1 門(mén)水平下的中華真地鱉腸道菌群結(jié)構(gòu) Y1、Y2、Y3這3個(gè)樣本的有效序列分別有98.7%、89.5%、98.8%能夠注釋到門(mén)水平，共檢測(cè)到31個(gè)菌門(mén)。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后相對(duì)豐度平均值排名前10的菌門(mén)見(jiàn)表2，可見(jiàn)其中相對(duì)豐度最高的是擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)，它們的相對(duì)豐度平均值均超過(guò)10%，是中華真地鱉腸道中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。剩下的21個(gè)菌門(mén)中，Hydrogenedentes、CKC4只在2個(gè)樣本中被檢出，酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、Candidate division SR1、熱微菌門(mén)(Thermomicrobia)、Omnitrophica只在1個(gè)樣本中被檢出。樣品中鑒定出來(lái)的菌群數(shù)量，自綱水平起都較多，因此選擇在門(mén)水平作聚類(lèi)分析，如圖2所示。關(guān)于樣品中各菌門(mén)含量的浮動(dòng)是否與不同菌群之間的相互作用有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

表2 3份樣本中相對(duì)豐度平均值前10的菌門(mén)

2.3.2 屬水平下中華真地鱉腸道菌群結(jié)構(gòu) Y1、Y2、Y3這3個(gè)樣本的全部有效序列分別有36.0%、40.6%、42.1%能注釋到屬水平，大部分有效序列不能在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行屬水平對(duì)應(yīng)分類(lèi)，說(shuō)明中華真地鱉腸道內(nèi)有許多待開(kāi)發(fā)的新菌屬。3個(gè)樣本中共檢測(cè)到309個(gè)菌屬，其中223個(gè)菌屬為3個(gè)樣本所共有的，52個(gè)菌屬在2個(gè)樣本中被檢出，34個(gè)菌屬只在1個(gè)樣本中被檢出。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后相對(duì)豐度平均值前15的菌屬見(jiàn)表3，其中Parabacteroides、Alistipes、沙雷氏菌屬(Serratia)、ChristensenellaceaeR-7group、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、CandidatusSymbiothrix、Clostridiumsensustricto1這7個(gè)菌屬的相對(duì)豐度平均值大于1%，可看作中華真地鱉腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌屬。

表3 3份樣本中相對(duì)豐度平均值前15的菌屬

3 討論

近年來(lái)，Illumina測(cè)序技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于腸道微生物多樣性的研究。該測(cè)序技術(shù)利用基于單分子簇的邊合成邊測(cè)序技術(shù)(sequencing by synthesis，簡(jiǎn)稱(chēng)SBS)和專(zhuān)有的可逆終止化學(xué)反應(yīng)，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量數(shù)據(jù)[15]。相較于分離培養(yǎng)方法和傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法，該技術(shù)有重大突破。分離培養(yǎng)方法分析的微生物只限于那些能夠在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物，而能通過(guò)傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法鑒定的微生物只占全部微生物的1%～10%[16]。因此通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法得到的結(jié)果并不能真實(shí)反映腸道菌群多樣性，這就使得用分離培養(yǎng)方法在研究腸道菌群的種群結(jié)構(gòu)與多樣性方面受到了極大的限制。

與第一代測(cè)序技術(shù)相比，高通量測(cè)序技術(shù)通量更大，并且成本相對(duì)較低[17-18]。Illumina Hiseq 2500平臺(tái)能在27 h內(nèi)生成相當(dāng)于人類(lèi)基因組40倍覆蓋率的數(shù)據(jù)[19]。與常用來(lái)分析微生物多樣性的變性梯度凝膠電泳(DGGE)相比，高通量測(cè)序技術(shù)靈敏度更高[20]。高通量測(cè)序技術(shù)有完美的定量功能，不但能夠測(cè)出某DNA屬于哪個(gè)物種，還能統(tǒng)計(jì)出該DNA在測(cè)序的過(guò)程中被測(cè)的次數(shù)，即被測(cè)樣品中該物種的數(shù)量，能夠直接反映某種DNA的豐度[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，中華真地鱉腸道中相對(duì)豐度最高的菌屬是Parabacteroides和Alistipes，這2個(gè)屬的細(xì)菌在人類(lèi)腸道中均有發(fā)現(xiàn)。腸易激惹綜合征和潰瘍性腸炎患者腸道內(nèi)的Parabacteroides菌屬含量較健康人體低，推測(cè)人體腸道內(nèi)缺乏Parabacteroides屬細(xì)菌可能會(huì)導(dǎo)致以上2種病癥的發(fā)生[22]。與健康人相比，自閉癥患者腸道中Alistipes菌屬的含量較低，目前導(dǎo)致這種情況的原因尚不明確[23]。而通過(guò)攝取動(dòng)物性食品則可讓人體腸道中Alistipes菌屬的含量上升[24]。除Parabacteroides和Alistipes這2個(gè)菌屬外，中華真地鱉腸道中還有沙雷氏菌屬等其他5個(gè)菌屬的細(xì)菌含量較高，這些細(xì)菌與中華真地鱉之間的關(guān)系，有待于進(jìn)一步研究。

人類(lèi)腸道微生物是宿主生理系統(tǒng)的一部分，可將其比喻為微生物組織，對(duì)于昆蟲(chóng)而言，腸道微生物也十分重要，昆蟲(chóng)腸道微生物有幫助宿主消化食物，為宿主提供食物中缺乏的必需營(yíng)養(yǎng)素，提高宿主抗病性，從而影響宿主生理和發(fā)育等作用[25-26]。在本研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步了解腸道內(nèi)各微生物對(duì)中華真地鱉的作用，以及它們與宿主和環(huán)境之間的關(guān)系后，就可以以此為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)微生態(tài)制劑。微生態(tài)制劑是采用有益微生物及其代謝產(chǎn)物和生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)制成的活菌制劑，無(wú)毒副作用、無(wú)殘留、不產(chǎn)生抗藥性[27]。

國(guó)內(nèi)對(duì)中華真地鱉的研究主要集中于有效成分的分離和藥用價(jià)值的研究。雖然我國(guó)已有多年中華真地鱉飼養(yǎng)歷史，但對(duì)養(yǎng)殖技術(shù)的深入研究較少。目前針對(duì)中華真地鱉腸病原菌引起的病害，一般以預(yù)防為主，對(duì)于已經(jīng)出現(xiàn)的病害，則采用施用廣譜抗生素的手段治理[28]。在飼料中添加抗生素，若超時(shí)超量，可能會(huì)對(duì)人類(lèi)健康造成危害[29]。早在2006年，歐盟各國(guó)已全面禁止抗生素作為動(dòng)物飼料添加劑，而微生態(tài)制劑作為一種新型的生物制劑是較理想的替代品[30]。如果研發(fā)出適用的微生態(tài)制劑，則能夠促進(jìn)我國(guó)中華真地鱉產(chǎn)業(yè)的大發(fā)展，市場(chǎng)前景十分樂(lè)觀。

4 結(jié)論

本研究首次應(yīng)用Illumina HiSeq高通量測(cè)序技術(shù)初步分析了中華真地鱉腸道菌群多樣性，共檢測(cè)到了31個(gè)菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)是擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)；共檢測(cè)到309個(gè)菌屬，優(yōu)勢(shì)菌屬是Parabacteroides、Alistipes、沙雷氏菌屬、ChristensenellaceaeR-7group、乳酸桿菌屬、CandidatusSymbiothrix、Clostridiumsensustricto1這7個(gè)。本試驗(yàn)結(jié)果為今后分析中華真地鱉生理生化特性、發(fā)展新型中華真地鱉養(yǎng)殖技術(shù)、研發(fā)適用于中華真地鱉的微生態(tài)制劑、開(kāi)發(fā)中華真地鱉腸道微生物資源提供了理論基礎(chǔ)。

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