楊志剛， 孫海燕， 羅 兵， 李晶晶， 周 莉

(常熟理工學(xué)院生物工程系，江蘇常熟 215500)

水稻雄性不育是在其有性繁殖過程中不能產(chǎn)生正常雄配子的現(xiàn)象，廣泛存在于開花植物中[1]。水稻雄性不育分為2種，一種是細胞質(zhì)雄性不育；另一種是細胞核雄性不育，由核基因突變產(chǎn)生，它的不育性是受細胞核控制，在植物中是比較普遍的，多為隱性細胞核不育。細胞核不育性徹底、穩(wěn)定，有利于縮短育種周期與提高產(chǎn)量[2-4]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些細胞核上的基因，控制雄性器官發(fā)育從而使雄性不育，如TDR、OsAPI5、Udt1、OsMYB80和PTC1等控制絨氈層發(fā)育[5]；OsMSP1控制孢子母細胞的數(shù)量；PCK、SDS、OsRAD21-3、PAIR2控制同源染色體配對；DPW、CYP704B2、Wda1、OsCP1、AID1等控制花藥小孢子的發(fā)育[6]，若是這些基因缺失或突變，不能產(chǎn)生花粉，從而導(dǎo)致雄性不育。更多雄性不育基因的發(fā)現(xiàn)將有助于更深入了解雄配子體發(fā)育機制。

本研究對粳稻品種93-63和引04-2雜交后代常農(nóng)粳7號中一個自然突變的雄性不育材料cnj7進行了初步的表型觀察、遺傳性狀分析和分子標記定位，為該基因的精細定位、克隆及其功能研究與利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻雄性不育突變體材料cnj7來源于一個93-63/引 04-2 雜交組合后代的自然突變體。其他野生型水稻材料明恢86 和R1128由常熟市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

1.2 突變體形態(tài)觀察及花粉育性鑒定

取突變體穎花做解剖鏡和半薄切片形態(tài)觀察；取花藥搗碎用1% I2-KI染色觀察，根據(jù)花粉粒形態(tài)和染色狀況分析花粉育性及敗育類型[7]。

1.3 突變性狀的遺傳

群體構(gòu)建[8]：2014年在常熟以cnj7突變體為母本，分別與明恢86和R1128雜交，在海南三亞種植F1并套袋自交，2015年在常熟種植F2。同時利用其與明恢86和R1128雜交衍生的F1作為父本與突變體測交，在常熟種植回交一代的植株，成熟時以群體為單位分析單株突變性狀分離的情況，進行遺傳分析。

1.4 基因定位

1.4.1 作圖群體 以組合cnj7/明恢86的F2群體作為該基因的定位群體，其中含有突變型單株112株，收集不育株，提取DNA。

1.4.2 水稻DNA的提取[9]將少許新鮮水稻葉片在液氮環(huán)境下磨碎倒入1.5 mL EP管中，加入650 μL CTAB，EP管放入65 ℃恒溫水浴30 min，加入650 μL氯仿，劇烈振蕩 30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，加入2倍體積無水乙醇，-20 ℃靜置1～2 h，再12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入500 μL 70%乙醇，洗去CTAB，干燥后加200 μL ddH2O溶解DNA，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 SSR分析 微衛(wèi)星引物分析[10-14]：以均勻分布于水稻染色體上的216對微衛(wèi)星引物[序列由康乃爾大學(xué)公布，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]篩選親本，差異標記分別在由cnj7、明恢86、3株可育株、3株不育株構(gòu)成的小群體中進行連鎖分析。對小群體得到的連鎖標記進一步在所有的不育單株中進行連鎖驗證和分析。

PCR擴增：反應(yīng)體系總體積20 μL，包括10.8 μL ddH2O、2 μL buffer、2 μL dNTP、2 pmol SSR、前后引物各1 μL、1 μL DNA模板、0.2 μLTaqDNA聚合酶、2 μL 50%甘油；擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，52 ℃退火20 s，72 ℃ 延伸20 s，40個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min；12 ℃保存。

電泳：PCR擴增產(chǎn)物加入10 μL Loading Buffer，沸水浴 10 min 后冰浴10 min，垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，1×TBE緩沖液，電壓220 V電泳2～3 h。

染色：染色液1 g/L的AgNO3，顯色液NaOH、Na2CO3、甲醛混合液?？梢姽庀掠涗涬娪痉蛛x結(jié)果。

1.5.4 遺傳作圖 在凝膠電泳分離結(jié)果中將具有明恢86帶型的單株標記為“1”，具有cnj7突變體帶型的單株標記為“2”，具有二者雜合帶型的單株記為“3”，利用Mapmaker 3.0軟件對分離群體的不育性狀和分子標記的分離數(shù)據(jù)進行連鎖分析，并進行遺傳圖距(cM)的計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體形態(tài)及花粉育性

由圖1可知，突變體植株整體及抽穗情況與正常植株無明顯差異性(圖A、圖B)。突變體最顯著的特點是不育，套袋自交的結(jié)實率接近于0%，自然環(huán)境下，異花授粉結(jié)實率低于8%。突變體小花解剖觀察發(fā)現(xiàn)，雌蕊形態(tài)數(shù)目與正常材料并無不同，雄蕊數(shù)目也正常；正常植株雄蕊顏色是淡黃色，且長勢飽滿(圖C、圖E)；突變體雄蕊顏色偏白，接近透明，形體萎縮(圖D、圖F)。將花藥搗碎碘染，顯微鏡下觀察，正常植株有染色很深的花粉粒，而突變體染色花粉粒稀少接近于無(圖G、圖H)，花藥內(nèi)沒有成熟花粉，該突變體是雄性不育株。

2.2 突變體半薄形態(tài)觀察

由圖2可知，野生型和突變體在小孢子母細胞階段沒有明顯變化，小孢子母細胞呈多面體形，胞質(zhì)濃厚，藥壁4層細胞分化和花粉母細胞發(fā)育完成；野生型花粉母細胞進行減數(shù)分裂；形成胼胝質(zhì)包裹的二分體、四分體，絨氈層細胞空泡化，胼胝質(zhì)壁降解，小孢子從四分體釋放；小孢子體積增大，內(nèi)部空泡增多，小孢子外壁逐漸增厚，經(jīng)2次有絲分裂，形成三孢花粉。而突變體從二分體時期即表現(xiàn)異常，小孢子個數(shù)增多，之后內(nèi)容物發(fā)生滲漏并最終導(dǎo)致小孢子降解，不能形成花粉。

2.3 突變性狀的遺傳

表1以突變體cnj7作為母本，分別與R1128、明恢86雜交衍生F2群體，同時利用cnj7×R1128、cnj7×明恢86的F1與突變體cnj7回交衍生BC1F1代植株，調(diào)查突變體形狀在各種背景下的分離，所有種群F1植株的育性均表現(xiàn)正常，但F2和BC1F1的育性出現(xiàn)分離，這表明育性性狀受核基因控制，不育性狀為隱性性狀。在所有雜交組合衍生的F2群體中，關(guān)于育性性狀的分離均符合3 ∶1 的分離規(guī)律，而在雜交組合的F1植株育性性狀分離則符合1 ∶1的分離規(guī)律，表明該不育性狀為單個基因控制的隱性突變[18]。

表1 突變性狀在群體中的分離

2.4 cnj7(t)基因的初步定位

以常農(nóng)粳7號、明恢86和雜交F1代構(gòu)成小群體，利用水稻12號染色體上均勻分布的微衛(wèi)星標記，實驗室合成216對標記引物在親本cnj7雄性不育突變體和明恢86間篩選具有多態(tài)性差異的標記[13]。將篩選出的58個多態(tài)性SSR標記引物分別對所有F2代不育性狀的樣本進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第9號染色體上微衛(wèi)星標記的R61552、RM556與突變體基因表現(xiàn)明顯的連鎖現(xiàn)象(圖3)。根據(jù)各標記在基因組上的位置，該突變基因被初步定位在第9號染色體的微衛(wèi)星標記 R61552～RM556之間，遺傳距離分別為20.6、11.3 cM(圖4)。

3 討論

水稻的雄性不育有2種，一種是細胞核不育，可穩(wěn)定遺傳；另一種是細胞質(zhì)不育，可以在某種條件下恢復(fù)育性。根據(jù)不育性狀的表達規(guī)律將細胞核不育分為隱性細胞核不育和顯性細胞核不育。根據(jù)文獻記載，發(fā)現(xiàn)了大約120種不育基因，細胞質(zhì)雄性不育的基因有20多個；其余的屬于細胞核不育基因，目前已有7個不育基因在第9號染色體明確并克隆，它們分別是OsDDM1a、OsCesA9、PAIR2、PTC1、OsGEN-L、OsUgp1和Ugp1，并且它們都屬于細胞核雄性不育；其中，OsDD1a影響水稻基因組的DNA甲基化水平；OsCesA9是纖維素合酶催化亞基，它可能形成一個纖維素合成復(fù)合體從而參與次生細胞壁的合成；PAIR2在能夠控制水稻細胞減數(shù)分裂時同源染色體的配對；PTC1是一個控制絨氈層發(fā)育、影響花粉粒形成的關(guān)鍵基因；OsGEN-L在水稻小孢子的發(fā)育初期有重要作用；OsUgp1和Ugp1催化葡萄糖的一系列反應(yīng)[9-12]。

隱性核不育這一類植株有利于改良水稻群種。通過雜交、測交、回交等手段將有利基因集中到一起，表達出更好的性狀，利用優(yōu)勢改良創(chuàng)造出更為優(yōu)質(zhì)的雜交水稻品種[18]。該研究利用不育突變體cnj7與明恢86雜交衍生分離群體，成功地將cnj7(t)定位在第9號染色體上SSR標記RM556～R61552之間，遺憾的是，可能是由于親本遺傳性狀差別并不是很大[9-12]，另外可能是由于標記引物的缺陷，并未能更加精確地確定雄性核不育突變基因的位置，所以進一步精確定位基因，重要的前提條件是親本間遺傳差異要足夠大、F1植株育性正常的分離群體。目前，我們正在研究配置親緣關(guān)系較遠、遺傳差異較大的一些雜交組合，期望能夠?qū)崿F(xiàn)對該基因的精細定位。

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