劉 徽,蔡 琳,廖海燕
新面醑為第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院生產(chǎn)的醫(yī)院制劑,臨床主要用于治療尋常痤瘡及頭皮脂溢性皮炎等,為常見的皮膚科用藥。其主要有效成分為甲硝唑、氯霉素、水楊酸,原《總后衛(wèi)生部非標(biāo)準(zhǔn)制劑標(biāo)準(zhǔn)》采用容量分析方法測定水楊酸的含量,卻未對甲硝唑和氯霉素含量做具體規(guī)定。為了實(shí)現(xiàn)對該制劑質(zhì)量的更好監(jiān)控,通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料[1-6],對甲硝唑和氯霉素含量測定方法,采用高效液相色譜(HPLC)法居多,筆者探討了采用HPLC法同時(shí)檢測甲硝唑、氯霉素、水楊酸含量的方法,供同仁參考。
1.1 儀器 高效液相色譜儀(島津,日本),優(yōu)普系列超純水器(型號:UPT-Ⅰ,生產(chǎn)廠家:成都超純科技有限公司),超聲波清洗器(型號:KQ5200E,生產(chǎn)廠家:昆山市超聲儀器有限公司),電子分析天平(型號:BT25S,生產(chǎn)廠家:賽多利斯)。
1.2 試藥 甲硝唑?qū)φ掌罚ㄖ袊称匪幤窓z定研究院,純度 99.9%,批號:100191-201507),氯霉素對照品(中國藥品生物制品檢定所,純度99.4%,批號:130555-201203),水楊酸對照品(中國食品藥品檢定研究院,100106-201104,純度:99.9%),甲醇(成都科龍化工試劑廠,批號:2013120401),磷酸(成都科龍化工試劑廠:批號:20130413),色譜甲醇(A455-4,飛世爾,美國),超純水(自制),新面醑(第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院生產(chǎn),批號:170207、170219、170316)。
2.1 溶液制備
2.1.1 對照品溶液制備 取甲硝唑、氯霉素、水楊酸對照品適量,加流動相制成每1 ml分別含甲硝唑0.1mg、氯霉素0.1mg、水楊酸0.0125mg的溶液,混合后作為對照品溶液。
2.1.2 供試品溶液制備 取新面醑2ml,置200ml量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,過濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液。
2.1.3 陰性對照溶液 按照處方,分別加入除甲硝唑、氯霉素和水楊酸以外的其他成分,制備陰性樣品100ml,按照“2.1.2”制備方法制成陰性對照溶液。
2.2 色譜條件 色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 Inertsustain C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇 -水(55∶45)(pH3.2),檢測波長 230 nm;柱溫 35℃,進(jìn)樣量:10 μl。
2.3 方法學(xué)考察
2.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 按照上述色譜條件進(jìn)樣對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各10μl,3組分出峰順序依次為甲硝唑、氯霉素、水楊酸(圖1)。3組分保留時(shí)間分別為4.4、7.0、10.0min,分離度分別為1.8、3.2、3.9,分離度均符合規(guī)定。結(jié)果顯示陰性對照溶液在主峰位置無色譜峰,專屬性良好。
2.3.2 線性關(guān)系考察 采用上述方法分別進(jìn)樣對照品溶液各 2、4、8、10、12、20 μl,記錄色譜圖。 以峰面積(A)對進(jìn)樣濃度 C(μg/ml)進(jìn)行線性回歸,得甲硝唑線性方程為:A=14956C+5142(n=6),r=0.9999;氯霉素線性方程為:A=10343C+3288.5(n=6),r=1;水楊酸線性回歸方程為:A=36578C-845.65(n=6),r=1。結(jié)果表明:甲硝唑、氯霉素、水楊酸分別在21.78~217.78 μg/ml、20.48~204.76 μg/ml、5.01~50.15 μg/ml范圍內(nèi),與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。
2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下對照品溶液,按照上述色譜條件依次連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄色譜圖,計(jì)算各組分峰面積的RSD,結(jié)果分別為0.4%(n=5)、0.6%(n=5)、0.7%(n=5),表明該方法精密度實(shí)驗(yàn)良好。
2.3.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取批號為170207供試品2ml,精密量取,分別置6個 200 ml量瓶中,按“2.1.2”處理制成供試品溶液,按照上述色譜條件依次進(jìn)樣,記錄色譜圖,計(jì)算3組分峰面積RSD分別為0.5%(n=6)、0.7%(n=6)、0.8%(n=6), 表明方法重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)良好。
2.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取批號為170207供試品2ml,照“2.1.2”處理得供試品溶液,室溫下存放,依次在同一天內(nèi)第 0、2、4、8、12、16、20、24 h 進(jìn)樣分析,分別記錄3組分峰面積,計(jì)算3組分含量RSD分別為 0.6%(n=8)、0.7%(n=8)、0.9%(n=8),結(jié)果表明供試品溶液中3組分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.3.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取批號為170207供試品1 ml(含甲硝唑、氯霉素、水楊酸分別為:10.02 mg/ml、10.04 mg/ml、2.52 mg/ml)各 9 份,分別置9個200ml量瓶中,再精密稱取甲硝唑、氯霉素、水楊酸對照品適量,分別按已測出供試品含量的80%、100%、120%各 3份投于上述量瓶中,按“2.1.2”方法制備成供試品溶液,按上述色譜條件分別進(jìn)樣10μl,記錄3組分峰面積和各對照品加入量,計(jì)算各組分平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)平均偏差,結(jié)果見表1。
2.4 樣品含量測定 取甲硝唑、氯霉素、水楊酸對照品適量,精密稱定;取3個批號的新面醑為樣品,按照“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下制成對照品溶液和供試品溶液,對照品溶液平行制備2份,供試品每批次平行制備3份,按照上述色譜條件依次進(jìn)樣,記錄3組分峰面積,按外標(biāo)法計(jì)算3組分含量,求平均含量和相對標(biāo)準(zhǔn)平均偏差(RSD)。 結(jié)果見表2。
表1 新面醑中甲硝唑、氯霉素、水楊酸回收率結(jié)果(n=9)
表2 新面醑中甲硝唑、氯霉素、水楊酸含量測定結(jié)果及RSD(mg/mI)
檢測波長的確定:本研究采用SPD-M20A二極管陣列檢測器,通過對3組分進(jìn)行全波長掃描檢測,水楊酸在230 nm處的吸光度最高,甲硝唑和氯霉素在此波長也存在吸收,且根據(jù)處方得知,水楊酸處方量較少,故采用230 nm作為3組分的共同檢測波長。
圖1 高效液相色譜圖
原標(biāo)準(zhǔn)在對該品種進(jìn)行質(zhì)量控制時(shí),只是采用容量分析方法對水楊酸進(jìn)行含量測定,顯然已不能滿足最新藥典的要求,為了患者用藥安全,本研究建立HPLC法對該品種3組分進(jìn)行全面質(zhì)量控制,探索通過一種色譜條件同時(shí)測定該品種中3組分含量的方法。通過對方法的精密度、重復(fù)性、回收率等參數(shù)進(jìn)行研究,結(jié)果表明,HPLC法測定本品時(shí)的精密度、重復(fù)性、回收率均良好,故該分析方法可以作為同時(shí)測定新面醑中3個主要成分含量的測定方法,為建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。
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