墻建軍，夏 飛，雷應(yīng)軍，劉海潮，胡振紅

(解放軍武漢總醫(yī)院，湖北 武漢 430070)

目前，肺結(jié)核仍然是嚴(yán)重危害人類健康的主要傳染病，是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會(huì)問題，也是我國重點(diǎn)控制的主要疾病之一。世界衛(wèi)生組織(WHO)新出版了《2015年全球結(jié)核病報(bào)告》顯示，2014年全球新發(fā)肺結(jié)核病人數(shù)為960萬，我國為94萬；全球患病率為174/10萬，我國為89/ 10萬；全球發(fā)病率為133/10萬，我國為68/10萬[1]。結(jié)核性胸膜炎(tuberculous pleurisy,TBP)是胸膜對結(jié)核菌高度變態(tài)反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的胸膜炎癥，為最常見的胸膜疾病之一，其發(fā)病率與結(jié)核病疫情相關(guān)，傳統(tǒng)檢查手段敏感性和特異性均較差，胸腔積液抗酸桿菌檢出率極低、培養(yǎng)陽性率低且耗時(shí)較長；胸膜活檢陽性率達(dá)60%～80%，但為有創(chuàng)傷檢查，不適合常規(guī)采用。γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-γ release assays, IGRAs)是近年來最為熱門的結(jié)核病診斷方法，其中包括基于全血的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和基于外周血淋巴細(xì)胞的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)。筆者通過對90例進(jìn)行了T-SPOT.TB、結(jié)核蛋白芯片以及腺苷脫氨酶(ADA)檢測患者的檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，以探討T-SPOT.TB在結(jié)核性胸膜炎診斷中的價(jià)值。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選取2015年1—12月在我院接受診治的胸腔積液患者90例，其中結(jié)核性胸膜炎50例(TBP組)，非結(jié)核性胸膜炎(非TBP組)40例。TBP組男39例，女11例；年齡18～84歲，平均48歲；病程1 d～3個(gè)月；患者癥狀、體征、各項(xiàng)檢查結(jié)果及抗結(jié)核治療效果均支持診斷。非TBP組男25例，女15例；年齡20～80歲，平均50歲；病程4 d～5個(gè)月；胸膜轉(zhuǎn)移癌23例，肺炎旁胸腔積液8例，心功能不全7例，肺栓塞2例；腫瘤病例均經(jīng)病理細(xì)胞學(xué)證實(shí)，其他疾病根據(jù)臨床癥狀、體征、常規(guī)化驗(yàn)檢查、影像學(xué)表現(xiàn)及療效等證實(shí)。納入標(biāo)準(zhǔn): 患者均行胸腔穿刺或胸腔置管引流胸腔積液，行血清T-SPOT.TB、血清結(jié)核蛋白芯片、胸腔積液結(jié)核蛋白芯片、胸腔積液ADA等檢查。結(jié)核性胸膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn): 胸膜活檢提示典型的結(jié)核病表現(xiàn)；胸腔積液涂片或培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌；除外其他原因引起的胸腔積液，抗結(jié)核治療有效[2]。

1.2 檢測方法

1.2.1T-SPOT.TB方法 采用T-SPOT.TB檢測試劑盒(英國Oxford Immunotec公司)對血液樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果判讀:第1孔為陰性對照孔，第4孔為陽性對照孔，如陽性對照孔出現(xiàn)斑點(diǎn)，說明試驗(yàn)成功。第2孔和3孔為測試孔，當(dāng)混合多肽ESAT-6或CFP-10孔達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)則判定為陽性結(jié)果：①如果陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)，測試孔斑點(diǎn)數(shù)-陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)；②如果陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，測試孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍的陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)。如出現(xiàn)以下情況判定試驗(yàn)結(jié)果為“不確定”：①空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)超過10個(gè)；②陽性質(zhì)控對照孔斑點(diǎn)數(shù)少于20個(gè)(除非混合多肽ESAT-6或CFP-10孔根據(jù)結(jié)果解釋和判斷標(biāo)準(zhǔn)確定為陽性)。

1.2.2結(jié)核蛋白芯片檢測方法 PBT-X2蛋白芯片閱讀儀及結(jié)核蛋白芯片試劑盒均由南京大淵生物技術(shù)公司提供。操作方法嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，結(jié)果根據(jù)儀器廠家設(shè)置參數(shù)自動(dòng)判別，分別打印出胸腔積液與血清中三種特異性抗體即脂阿拉伯甘露糖(LAM)、 16 kDa及38 kDa抗體，如果任意抗體檢測陽性，結(jié)果判定為陽性。

1.2.3ADA測定 應(yīng)用10 mL抗凝玻璃管收集胸腔積液10 mL，1 000 r/min離心5 min，取上清液用酶法(北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司試劑盒，批號(hào)：12-1021P)測定胸腔積液ADA活性，參照試劑盒說明書進(jìn)行診斷，ADA≥45 IU/L定義為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料比較行2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1

2組3種檢測方法陽性率比較 TBP組血清T-SPOT.TB陽性率明顯高于血清結(jié)核蛋白芯片、胸腔積液結(jié)核蛋白芯片、胸腔積液ADA(P均<0.05)。非TBP組血清T-SPOT.TB陽性率與血清及胸腔積液結(jié)核蛋白芯片、胸腔積液ADA比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

2.2

3種檢測方法的靈敏性與特異性對比 血清T-SPOT.TB靈敏性明顯高于血清結(jié)核蛋白芯片、胸腔積液結(jié)核蛋白芯片(P均<0.05)，但與胸腔積液ADA比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；胸腔積液ADA靈敏性與血清及胸腔積液結(jié)核蛋白芯片比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。血清T-SPOT.TB特異性明顯高于血清結(jié)核蛋白芯片、胸腔積液結(jié)核蛋白芯片及胸腔積液ADA(P均<0.05)；胸腔積液ADA特異性明顯高于血清及胸腔積液結(jié)核蛋白芯片(P均<0.05)。見表2。

表1 3種檢測方法陽性率對比 例(%)

注：①與T-SPOT.TB陽性率比較，P<0.05。

表2 3種檢測方法的靈敏性與特異性對比 %(例/例)

注：①與T-SPOT.TB比較，P<0.05;②與ADA比較，P<0.05。

3 討 論

蛋白芯片是近年來蛋白組學(xué)研究中的新方向。結(jié)核蛋白芯片系統(tǒng)是以微孔濾膜為載體，將純化的結(jié)核菌LAM、16 kD及38 kD等3種抗原固相在同一膜片上，利用微孔濾膜的滲濾、濃縮、凝集作用，使抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進(jìn)行，再以免疫標(biāo)記顯色后通過芯片閱讀儀對不同抗原點(diǎn)陣的灰度值進(jìn)行同步檢測，從而對結(jié)核菌感染的情況進(jìn)行診斷[3]。本芯片包被了以上3種抗原，只要其中任何一對應(yīng)抗體與之反應(yīng)即為陽性。從文獻(xiàn)報(bào)道來看，結(jié)核蛋白芯片靈敏度偏低，陳鄒陽[4]隨機(jī)選擇結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液患者80例行外周血結(jié)核蛋白芯片檢測，靈敏性為72.5%，特異性為90.6%；陶波山[5]對102例結(jié)核性胸膜炎患者的胸腔積液、血清和48例非結(jié)核性胸膜炎患者的胸腔積液、血清分別用ADA、結(jié)核蛋白芯片和結(jié)核分枝桿菌特異性ELISPOT 3種方法進(jìn)行檢測，結(jié)果示胸腔積液結(jié)核蛋白芯片靈敏性為52.9%，特異性為89.6%，血清結(jié)核蛋白芯片靈敏性為74.5%，特異性為93.8%；本研究中，血清結(jié)核蛋白芯片靈敏性、特異性分別為70.4%，50.8%，胸腔積液結(jié)核蛋白芯片靈敏性、特異性分別為69.6%，49.3%，靈敏性與上述報(bào)道一致，但特異性均低。

ADA是一種分布廣泛的酶，催化腺苷轉(zhuǎn)化為肌苷和脫氧腺苷為脫氧肌苷，在T淋巴細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用。ADA在淋巴細(xì)胞分化和單核細(xì)胞成熟為巨噬細(xì)胞的過程中起到一定作用，當(dāng)發(fā)生結(jié)核性胸膜炎時(shí)，宿主通過細(xì)胞免疫抵抗結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染，胸膜的淋巴細(xì)胞明顯增多、活性增強(qiáng)，故ADA在胸腔積液中含量明顯增高。Piras等最早報(bào)道ADA作為胸腔積液輔助鑒別診斷分子標(biāo)識(shí)，之后圍繞其對結(jié)核性胸膜炎的診斷應(yīng)用價(jià)值有大量的研究。劉菲等[6]研究結(jié)果顯示，胸腔積液ADA靈敏性、特異性分別為71.2%，92%。一項(xiàng)納入63項(xiàng)研究、8 000例胸膜炎 (其中2 796例為結(jié)核性胸膜炎)患者的薈萃分析顯示，敏感性、特異性分別為92%,90%[7]。本研究結(jié)果顯示，胸腔積液ADA靈敏性、特異性分別為88.1%,72.9%。導(dǎo)致結(jié)果不一致的原因可能與檢測方法多樣、截?cái)嘀挡煌嘘P(guān)，而其他因素如患者的免疫狀況、種族、地區(qū)結(jié)核流行情況也可影響ADA水平和結(jié)果判斷。血液中ADA主要存在于紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，其活性約為血清的40～70倍。尉艷霞等[8]回顧性分析91例經(jīng)內(nèi)科胸腔鏡胸膜活檢病理確診為結(jié)核性胸腔積液(結(jié)核組49例)和惡性胸腔積液(惡性組42例)患者的胸腔積液及血清中ADA活性，結(jié)果表明，結(jié)核性胸膜炎和惡性胸腔積液的血清ADA均在正常范圍，且兩者的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陶波山[5]研究表明血清的ADA檢測結(jié)核性胸膜炎組與非結(jié)核性組無顯著性差異?；谘錋DA檢測對結(jié)核性胸膜炎診斷價(jià)值有限，本研究未納入該方法。

IGRAs是檢測MTB特異性抗原刺激T細(xì)胞產(chǎn)生的γ-干擾素，以判斷是否存在MTB的感染。目前國際上較成熟的IGRAs有2種:①采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測全血中致敏T細(xì)胞再次受到MTB特異性抗原刺激后釋放的γ-干擾素水平，稱之為全血檢測或結(jié)核感染T細(xì)胞免疫檢測；②采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)測定在MTB特異性抗原刺激下，外周血單個(gè)核細(xì)胞中能夠釋放γ-干擾素的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量，稱之為細(xì)胞檢測或結(jié)核感染T細(xì)胞檢測。由于ELISPOT技術(shù)是從單細(xì)胞水平進(jìn)行檢測，可及時(shí)捕獲細(xì)胞周圍分泌的細(xì)胞因子，故敏感度更高。Dai等[9]檢索了中文和英文的數(shù)據(jù)庫，對檢索到的36篇英文和25篇中文文獻(xiàn)進(jìn)行了薈萃分析，結(jié)果顯示IGRAs的總體敏感度和特異度分別為85%和84%。Menzies等[10]對1966—2006年的相關(guān)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)進(jìn)行的薈萃分析結(jié)果顯示，結(jié)核感染T細(xì)胞免疫檢測和結(jié)核感染T細(xì)胞檢測的總體特異度分別為97.7%和92.5 %。劉紅等[11]回顧性分析2011年2—10月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的結(jié)核病疑似患者1 084例， 384例(35.4%)確診為結(jié)核病患者，54例為實(shí)驗(yàn)室診斷，其中42例T-SPOT. TB結(jié)果陽性，敏感性為77.8%(42/54);330例為臨床診斷，其中289例T-SPOT. TB結(jié)果陽性，敏感性為87.6%(289/330)。T-SPOT. TB的綜合敏感性為86.2%(331/384)。李津等[12]報(bào)道，通過IGRAs檢測胸腔積液診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感性為90.1%，特異性為88.0%。另一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，胸腔積液T-SPOT.TB檢測的敏感度和特異度可以達(dá)到95.7%和100.0%，顯著高于ADA(55.5%和86.3%)[13]。本研究血清T-SPOT. TB靈敏性、特異性分別為93.9%，90.2%，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，顯示血清T-SPOT. TB靈敏性、特異性明顯優(yōu)于結(jié)核蛋白芯片法，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血清T-SPOT. TB靈敏性優(yōu)于胸腔積液ADA，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血清T-SPOT. TB特異性優(yōu)于胸腔積液ADA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

IGRAs在不同地區(qū)、不同人群中的靈敏性和特異性均存在較大差異，此外，不同IGRAs產(chǎn)品使用的抗原、檢測試劑、檢測參數(shù)和界值設(shè)定等可能存在差異，對最終檢測結(jié)果及其判讀有一定影響。國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)的IGRAs僅限于血液樣本的檢測，即IGRAs對體液或組織標(biāo)本的研究尚未經(jīng)過充分驗(yàn)證，不能得出可靠的結(jié)論；我院尚未開展胸水T-SPOT.TB，故未能進(jìn)行胸水T-SPOT.TB對比分析。由于我院開展血清T-SPOT. TB較晚，樣本數(shù)據(jù)量偏少，故研究結(jié)果有一定局限性，對T-SPOT. TB診斷結(jié)核性胸膜炎或結(jié)核病的臨床應(yīng)用價(jià)值做出更科學(xué)準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)仍需進(jìn)行大規(guī)模研究。

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