曾梓豪 羅璇 姚裕恒 王軍義

氧化應(yīng)激損傷是多種感音神經(jīng)性聾(噪聲暴露、電離輻射、藥物毒性等)的病理學(xué)基礎(chǔ)[1]，由于氧化應(yīng)激產(chǎn)生高水平的活性氧(氧自由基，reactiveox-ygenspecies,ROS)對耳蝸毛細(xì)胞生物大分子有很強(qiáng)的損傷作用，不僅可導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)的直接損傷，還通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的大量基因轉(zhuǎn)錄和相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活影響細(xì)胞的生物學(xué)過程，嚴(yán)重?fù)p傷可能導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡[2]。目前發(fā)現(xiàn)的與耳蝸毛細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號通路包括線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑、死亡受體途徑[3]，而酪氨酸激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子(janus kinase-signal transducers and activators of transcription,JAK-STATs)信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條由細(xì)胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等重要的生物學(xué)過程[4,5]；與其它信號通路相比，這條信號通路的傳遞過程相對簡單，主要由三個成分組成，即酪氨酸激酶相關(guān)受體、酪氨酸激酶(Janus kinase，JAK)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and activators of transcription，STAT)。JAK-STAT信號通路在以氧化應(yīng)激損傷為基礎(chǔ)的感音神經(jīng)性聾的相關(guān)性研究中少有報道，本研究擬通過構(gòu)建體外培養(yǎng)毛細(xì)胞凋亡模型，分析檢測JAK-STAT信號通路中各STAT因子(STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6)的變化，以探討JAK-STAT信號通路與毛細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，為多種感音神經(jīng)性聾的發(fā)生機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1毛細(xì)胞株 采用HEI-OC1細(xì)胞株(由House研究所提供)，該細(xì)胞株系美國House研究所(House Ear Institute，HEI)從永生化小鼠耳蝸Corti器分離培育出來的一種能夠體外培養(yǎng)傳代的毛細(xì)胞株。

1.2儀器和試劑 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(上海錫諾儀器有限公司，中國)，叔丁基過氧化氫(t-BHP)溶液(Sigma，美國)(0、20、40、60 μM)，移液槍(Thremo，美國)，槍頭流式細(xì)胞儀(Thremo，美國)，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物公司，中國)，PBS緩沖液(HyClone，美國)，氯仿(凱信化工試劑有限公司，中國)，胎牛血清(HyClone，美國)，胰酶Tryple Express Enzyme(Gibco，美國)，DEPC(生工生物工程股份有限公司，中國)，F(xiàn)ermentas 反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1622(MBI Fermenta，美國)，F(xiàn)ermentas K0223 qPCR試劑盒(MBI Fermenta，美國)，引物設(shè)計合成(廣州賽哲生物公司，中國)，BPX-82型恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)公司，中國)。

1.3實驗方法

1.3.1毛細(xì)胞凋亡模型的構(gòu)建 t-BHP溶液稀釋為0 μM(對照組)、20 μM(低濃度組)、40 μM(中濃度組)、60 μM(高濃度組)4種濃度，取正常生長的HEI-OC1細(xì)胞，于33°C、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后加入以上4種濃度的t-BHP溶液，在33°C、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，15小時后收集各孔內(nèi)上清液。不含EDTA的胰酶消化貼壁細(xì)胞，相應(yīng)上清重懸收集并在2 000 rpm條件下離心5 min；用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次2 000 rpm離心5 min；500 μl Binding Buffer 重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 5 μl，加入PI 5 μl，混勻，室溫避光染色15 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.2實時熒光定量PCR檢測STATs mRNA表達(dá) 提取RNA，65 ℃反應(yīng)5 min、冰上冷卻3～5 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)嚴(yán)格按照Promega A5001試劑盒進(jìn)行操作，樣品于冰上冷卻，于25 ℃加入5XReaction Buffer， Ribonuclease Inhibitor，Reverse Transcriptase，PCR Nucleotide Mix(dNTP 混合)，MgCl2和Nuclease-Free Water反應(yīng)5 min，42 ℃中孵育60 min，70 ℃反應(yīng)10 min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。加入2×qPCR Master Mix 10 μl，10 μM Forward primer 0.3 μl，10 μM Reverse primer 0.3 μl，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍cDNA template 0.8 μl，ddH2O 8.6 μl，混勻、離心。反應(yīng)條件：95 ℃反應(yīng)10 min，進(jìn)行1次，然后95 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃反應(yīng)20 s，70 ℃反應(yīng)20 s，重復(fù)40次，最后95 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃反應(yīng)1 min，95 ℃反應(yīng)15 s，進(jìn)行1次，完成解離。應(yīng)用2-△△Ct法對STATs mRNA表達(dá)進(jìn)行相對定量檢測，以2-△△Ct表示染毒組STATs mRNA相對于正常對照組表達(dá)的變化倍數(shù)，每組細(xì)胞每個基因重復(fù)6次。引物設(shè)計合成見表1。

表1 各STATs mRNA引物序列

2 結(jié)果

2.1t-BHP誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞株凋亡水平 各組HEI-OC1細(xì)胞凋亡水平見圖1，與對照組(凋亡率3.9%)相比，20、40、60 μM染毒組的細(xì)胞凋亡率明顯上升，分別為7.4%、32.0%、91.2%。

2.2各濃度t-BHP染毒組STATs mRNA表達(dá)水平 各組STATs mRNA表達(dá)水平見表2。與對照組相比，染毒后STAT1 mRNA的表達(dá)水平顯著下降(F=5 534.302，P<0.01)，各染毒組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；染毒后STAT2 mRNA的表達(dá)水平均有顯著變化(F=1 259.148，P<0.01)，低濃度組STAT2 mRNA的表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)，但中、高濃度組均出現(xiàn)明顯升高(P<0.01)；染毒后各組STAT3 mRNA的表達(dá)水平均顯著下降(F=146.038，P<0.01)，但各染毒組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；STAT4在HEI-OC1細(xì)胞株中未見表達(dá)；染毒后各組STAT5 mRNA的表達(dá)水平均顯著下降(F=685.929，P<0.01)，各染毒組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；染毒后各組STAT6 mRNA的表達(dá)水平均顯著下降(F=516.11，P<0.01)，但各染毒組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 不同濃度t-BHP組的HEI-OC1細(xì)胞凋亡程度比較

表2 各組STATs mRNA表達(dá)水平比較(2-ΔΔCtt值，

3 討論

JAK-STAT信號通路與細(xì)胞的凋亡、增殖及分化密切相關(guān)，其傳遞的基本過程可概括為：多種細(xì)胞因子與其相應(yīng)的膜受體結(jié)合促進(jìn)JAKs磷酸化而被活化，活化的JAKs的JHl結(jié)構(gòu)域催化STATs上相應(yīng)部位的酪氨酸殘基磷酸化，同時STATs 的SH2功能區(qū)與受體中磷酸化的酪氨酸殘基作用而使 STATs活化，活化的STATs形成同源或異源二聚體進(jìn)入核內(nèi)，同其他一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄[6]。STATs是該通路的關(guān)鍵節(jié)點，目前已發(fā)現(xiàn)STAT家族存在7個成員：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6[7]，STATs蛋白廣泛表達(dá)于機(jī)體不同類型的細(xì)胞和組織中，參與細(xì)胞生長、分化、凋亡等多種生理功能的調(diào)控，并與炎癥、腫瘤和免疫反應(yīng)關(guān)系密切[8]，而這7個成員在不同的研究中所表現(xiàn)的生物學(xué)功能并無一致的觀點，而本研究采用的小鼠源HEI-OC1細(xì)胞株STAT5只有一種形態(tài)，并無亞型區(qū)分。

目前相關(guān)的研究熱點主要是STAT1、STAT3，有研究[9]發(fā)現(xiàn)IFN-γ抑制培養(yǎng)細(xì)胞生長的功能依賴于STAT1的轉(zhuǎn)錄激活活性，STAT1有抑制鱗狀上皮細(xì)胞生長及促進(jìn)凋亡作用，同時其他刺激，如：加熱、缺血、DNA損傷都可以通過STAT1促發(fā)凋亡[10]，但本研究結(jié)果顯示凋亡HEI-OC1細(xì)胞STAT1表達(dá)水平明顯下降，推測STAT1可能具有抑制HEI-OC1細(xì)胞凋亡的作用。目前研究STAT2主要是通過與STAT其它成員形成異源二聚體發(fā)揮生物學(xué)作用[11]，如：STATl-STAT2二聚體在腫瘤細(xì)胞持續(xù)被激活，通過上調(diào)編碼凋亡抑制基因和細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，如：Bcl-x(L)、Mcl-1、cyclinsDl/2及C-Myc等，進(jìn)而在腫瘤細(xì)胞血管生成、增殖、凋亡等多種生物學(xué)功能中發(fā)揮作用[12]；但也有研究認(rèn)為STAT2在IFN介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在STAT2的SH2保守區(qū)域內(nèi)，Y631突變?yōu)閅631F可影響Ⅰ型IFN凋亡效應(yīng)的信號傳導(dǎo)[13]；有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)STAT2是Ⅰ型IFN誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡關(guān)鍵介質(zhì)，STAT2表達(dá)缺失會明顯降低IFN-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡能力[14]；本研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重凋亡的HEI-OC1細(xì)胞STAT2 mRNA表達(dá)水平相對于對照組明顯升高，推斷STAT2具有促進(jìn)HEI-OC1細(xì)胞凋亡的生物學(xué)作用。STAT3主要通過細(xì)胞因子(如 IL-6)和生長因子(如VEGF)誘導(dǎo)的 JAK-STAT 信號途徑以及MAPK途徑激活，活化的STAT3形成同源或異源二聚體行使基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能[15]，其主要生物學(xué)功能是參與細(xì)胞生長、分化、惡性轉(zhuǎn)化及凋亡抑制，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管形成，具有抗凋亡作用，而且STAT3過度激活可表現(xiàn)出致癌基因作用[16]；本研究結(jié)果顯示凋亡的HEI-OC1細(xì)胞STAT3 mRNA的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下降，推斷STAT3 mRNA具有抑制HEI-OC1細(xì)胞凋亡的生物學(xué)作用。目前研究[17]發(fā)現(xiàn)STAT4的表達(dá)和功能除受上游IL-12、IL-23等細(xì)胞因子調(diào)控外，也受自身單核苷酸多態(tài)性調(diào)控，其在B細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上的變異可能通過抑制凋亡、產(chǎn)生炎癥性細(xì)胞因子、遞呈自身抗原、產(chǎn)生自身抗體來影響自身免疫性疾病進(jìn)程[18]；在本研究中，HEI-OC1細(xì)胞中未見STAT4表達(dá)。STAT5可在許多細(xì)胞因子包括生長激素、血小板生成素、白血病抑制因子 (LIF)和白介素 2、3、5、6 等刺激下被激活[19]，激活的STAT5通過調(diào)控一系列下游靶基因(細(xì)胞調(diào)節(jié)因子cyclin D1、cyclin D2、p21WAF/Cip1和p27kip，抗凋亡基因Bcl-xl、Bcl-2)的表達(dá)，對維持細(xì)胞正常功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化起到重要作用[20]，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[21]抑制STAT5a和STAT5b可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞生長；本研究中，t-BHP染毒后各組HEI-OC1細(xì)胞中STAT5 mRNA的表達(dá)水平均顯著下降，推斷STAT5 mRNA具有抑制HEI-OC1細(xì)胞凋亡的生物學(xué)作用。已有相關(guān)研究[22]證實STAT6可調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，但其在細(xì)胞凋亡中的作用并無一致性觀點，如：通過對STAT6活化狀態(tài)時不同的人淋巴細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，STAT6null表型的淋巴細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率高，認(rèn)為STAT6在細(xì)胞凋亡抑制中起重要作用[23]，以上研究表明STAT6可能有抑制細(xì)胞凋亡的生物學(xué)作用，但對人結(jié)腸癌細(xì)胞株細(xì)胞的Caspase家族蛋白以及Bcl-2家族蛋白的mRNA表達(dá)差異性研究發(fā)現(xiàn)HT-29(STAT6high)中凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-xl的表達(dá)反而比在Caco-2(STAT6null)中低，說明還有其他基因在凋亡的調(diào)控中起重要作用[24]；本研究中，染毒后各組STAT6 mRNA的表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著下降，推斷STAT6 具有抑制HEI-OC1細(xì)胞凋亡的生物學(xué)作用。由于STATs均以同源或異源二聚體的形式發(fā)揮靶基因的調(diào)控作用，本研究僅以凋亡毛細(xì)胞各STAT mRNA的表達(dá)水平作凋亡效應(yīng)的相關(guān)性分析具有一定的局限性，研究顯示毛細(xì)胞不同凋亡水平與STATs mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性不強(qiáng)，也可能由上述原因所致。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了氧化應(yīng)急損傷的毛細(xì)胞凋亡模型，并且發(fā)現(xiàn)隨著t-BHP染毒的濃度升高HEI-OC1細(xì)胞株凋亡水平升高，在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)各組STATs mRNA表達(dá)水平均出現(xiàn)了顯著性變化，STAT2 mRNA在本次研究中的表達(dá)水平明顯升高，而其它各STATs mRNA均出現(xiàn)表達(dá)水平下降，推測JAK-STAT2信號通路具有促進(jìn)凋亡的生物學(xué)作用，JAK-STAT1/STAT3/STAT5/STAT6信號通路具有抑制凋亡的生物學(xué)作用；可見氧化應(yīng)急損傷致毛細(xì)胞凋亡與JAK-STAT信號通路具有密切關(guān)系，該通路可能是氧化損傷致毛細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一，而JAK-STAT信號通路中關(guān)鍵因子STATs表達(dá)水平的不同變化也反映了其在凋亡過程中不同的作用機(jī)制，但其作用的分子機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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