禚志紅 張 靜 李國(guó)棟 王懷立△

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，河南 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450052

癲癇是兒童神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的慢性疾病，約30%的患兒發(fā)展為難治性癲癇，藥物治療困難。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，炎癥在癲癇發(fā)作的發(fā)生及維持方面發(fā)揮著復(fù)雜而重要的作用，深入研究炎癥與癲癇發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，有可能為難治性癲癇的病因治療提供一定的線(xiàn)索。本研究在海人酸(kainic acid，KA)誘導(dǎo)幼年大鼠癲癇發(fā)作前2 h腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)預(yù)處理，檢測(cè)急性期海馬組織Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)、高遷移率族蛋白(High mobility group protein 1，HMGB1)的基因及蛋白、磷酸化核因子抑制蛋白α(phosphorylated IkappaB-alpha，P-IκB-α)的蛋白表達(dá)水平，探討脂多糖預(yù)處理對(duì)幼鼠癲癇發(fā)作的影響以及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：出生21 d的清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量40～50 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(豫)2015-0004。隨機(jī)分為生理鹽水組7只(對(duì)照組)、海人酸誘導(dǎo)組26只(模型Ⅰ組)、LPS預(yù)處理組31只(模型Ⅱ組)。每組造模成功后且存活的動(dòng)物再隨機(jī)分為3 h、24 h兩個(gè)亞組，對(duì)照組僅設(shè)3 h亞組，每個(gè)亞組7只。

1.1.2 主要試劑：KA(美國(guó)santacruz，SC-200454A)；LPS(美國(guó)Sigma，DG-L2880)；RNA提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司，SK1312)；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo scientific，K1621)；熒光定量PCR預(yù)混液(美國(guó)Thermo scientific，K0251)；全蛋白提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司，BSP003)；改良型BCA法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(上海生工生物工程有限公司，SK3051)；磷酸酶抑制劑復(fù)合物Ⅲ(上海生工生物工程有限公司，PL019)；抗β-actin兔多克隆抗體(中國(guó)BBI，AB10024)；抗TLR4兔多克隆抗體(英國(guó)abcam，ab13556)；抗P-IκB-α小鼠多克隆抗體(美國(guó)Santacruze，sc-8404)；抗HMGB1兔多克隆抗體(英國(guó)abcam ab191583)；山羊抗小鼠IgG (中國(guó)BBI，D110087)；猴抗兔IgG(中國(guó)BBI，AB10056)。

1.1.3 主要儀器：超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo scientific，NANODROP 2000)；熒光定量PCR儀(瑞士Roche，LightCycler 480Ⅱ)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma，1-14K)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices，SpectraMax i3x)；垂直電泳槽(美國(guó)Biorad，Mini-Protean 3)；轉(zhuǎn)移電泳槽(美國(guó)Biorad)；轉(zhuǎn)移電泳儀(美國(guó)Biorad，Powerpac)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Syngene，G：BOX Chemi-XT4)。

1.2方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備及行為學(xué)觀察：模型組Ⅰ及對(duì)照組腹腔注射等量的生理鹽水，模型組Ⅱ腹腔注射LPS(100 μg/kg)。模型組Ⅰ和模型組Ⅱ注射生理鹽水/LPS后2 h腹腔注射KA(12 mg/kg)以誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，對(duì)照組注射等量的生理鹽水。觀察注射KA/生理鹽水后2 h內(nèi)各組大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，根據(jù)Racine標(biāo)準(zhǔn)對(duì)KA誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作進(jìn)行分級(jí)：Ⅰ級(jí)：面肌抽動(dòng)，節(jié)律性咀嚼動(dòng)作；Ⅱ級(jí)：節(jié)律性點(diǎn)頭或濕狗樣抖動(dòng)；Ⅲ級(jí)：一側(cè)前肢陣攣；Ⅳ級(jí)：雙側(cè)前肢陣攣并站立；Ⅴ級(jí)：全身強(qiáng)直陣攣、跌倒[1]。Ⅳ級(jí)及以上為造模成功，SE持續(xù)2 h后，將水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射使發(fā)作終止，未達(dá)到Ⅳ級(jí)者從模型組中剔除。SE后3 h、24 h留取腦組織備用。

1.2.2 熒光定量PCR法檢測(cè)海馬內(nèi)TLR4基因和HMGB1基因：①引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)Gene Bank中 SD大鼠TLR4、HMGB1及β-actin的基因序列，Primer Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列(見(jiàn)表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。引物用DEPC水配制為100 μM的工作液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。②總RNA的提取和CDNA的合成：在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)將大鼠處死，冰上操作分離海馬組織，按說(shuō)明書(shū)提取海馬組織中的總RNA；用Thermo Scientific Nano Drop2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度。依說(shuō)明書(shū)進(jìn)行mRNA的反轉(zhuǎn)錄、合成CDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。③Q-PCR反應(yīng)：參照Thermo Scientific Maxima SYBR Green qPCR 預(yù)混液說(shuō)明書(shū)在Light Cycler 480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。分析熔解曲線(xiàn)特異性，2-△△Ct分析法對(duì)大鼠海馬組織TLR4、HMGB1基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，得相對(duì)表達(dá)倍數(shù)為N(N =2-△△Ct)，其中△△Ct=(待測(cè)組的目的基因平均Ct值-待測(cè)組管家基因平均Ct值)-(對(duì)照組的目的基因平均Ct 值-對(duì)照組管家基因平均Ct 值)。

表1 TLR4、HMGB1基因引物序列

1.2.3 Westernblot檢測(cè)海馬內(nèi)TLR4蛋白、P-IκB-α蛋白、HMGB1蛋白的表達(dá)

1.2.3.1 海馬組織蛋白提?。捍笫笤谙鄳?yīng)時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦，冰上快速分離海馬組織。蛋白提取按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。提取蛋白后按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白定量。

1.2.3.2 SDS-PAGE凝膠電泳：將玻璃板洗凈后用雙蒸水浸泡沖洗。根據(jù)目的蛋白分子量選擇相應(yīng)濃度的下層分離膠。依次配制分離膠和5%的濃縮膠，待濃縮膠聚合后，將待測(cè)樣品與上樣液充分混合，99 ℃水浴5 min。加入電泳緩沖液，蛋白樣品按30 μg依次上樣。開(kāi)始電泳，電泳時(shí)間1.5～2 h。

1.2.3.3 轉(zhuǎn)膜：預(yù)先用甲醇浸泡PVDF膜15 ～ 20 min，蒸餾水漂洗，后浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中。按照：負(fù)極-海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊-正極的順序放置，關(guān)閉轉(zhuǎn)膜夾并插入充滿(mǎn)緩沖液的轉(zhuǎn)移電泳槽中。將電泳槽置于4 ℃冰盒中，200 mA恒流轉(zhuǎn)移1 h。

1.2.3.4 封閉和雜交：5%的脫脂牛奶室溫封閉1～2 h。TBST振蕩洗滌3次×10 min。用一抗稀釋液分別配制一抗工作液β-actin (1：5 000)，HMGB1 (1：700)，TLR4 (1：700)，P-IκB-α(1：50)；將PVDF膜放入一抗工作液中4 ℃過(guò)夜。TBST振蕩洗滌3次×10 min。將PVDF膜放入用5%脫脂牛奶配制的相應(yīng)二抗工作液中，室溫孵育1 h。TBST振蕩洗滌3次×10 min。

1.2.3.5 顯影反應(yīng)：選擇ECL發(fā)光法，采用數(shù)字凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，使用Image-Pro Plus 5.0軟件分析條帶光密度，將目的蛋白條帶的光密度值與內(nèi)參(β-actin)的光密度值做比值，計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1各組幼鼠癲癇發(fā)作成功及死亡情況比較行為學(xué)觀察模型Ⅰ組共26只SD鼠達(dá)SE并存活16只，模型Ⅱ組共31只SD鼠達(dá)SE并存活17只。模型Ⅰ組和模型Ⅱ組大鼠在KA注射后2 h內(nèi)均出現(xiàn)行為改變，容易激惹、攻擊性強(qiáng)、飲食減少。見(jiàn)表2。

表2 各組幼鼠癲癇發(fā)作成功及死亡情況比較

2.2熒光定量PCR檢測(cè)急性期海馬組織TLR4基因、HMGB1基因的表達(dá)模型Ⅰ組、Ⅱ組在SE后3 h、24 h海馬TLR4及HMGB1基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。SE后3 h模型Ⅱ組TLR4表達(dá)量顯著高于Ⅰ組，SE后24 h無(wú)顯著性差異；SE后3 h、24 h模型Ⅰ組HMGB1表達(dá)量與模型Ⅱ組比較無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表3、4。

表3 各組SE后3 h和24 h海馬TLR4基因表達(dá)倍數(shù)比較

注：SE：癲癇持續(xù)狀態(tài)，Ct：熒光閾值循環(huán)數(shù)，TLR4：Toll樣受體4，對(duì)照組2-△△CT均為1，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，與生理鹽水比較：t=4.806，a1P<0.05；t=4.954，a2P<0.05；t=3.924，a3P<0.05；t=3.792，a4P<0.05；與模型Ⅰ組(3 h)比較：t=2.362，b1P<0.05；與模型Ⅰ組(24 h)比較：t=0.589，c1P>0.05

表4 各組SE后3 h和24 h海馬HMGB1基因表達(dá)倍數(shù)比較

注：SE：癲癇持續(xù)狀態(tài)，Ct：熒光閾值循環(huán)數(shù)，HMGB1：高遷移率族蛋白1，對(duì)照組2-△△CT均為1，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，與生理鹽水比較：t=3.626，a5P<0.05，t=5.255，a6P<0.05，t=4.046，a7P<0.05，t=2.836，a8P<0.05；與模型Ⅰ組(3 h)比較：t=0.569，b2P>0.05；與模型Ⅰ組(24 h)比較：t=0.691，c2P>0.05

2.3各組SE后3 h、24 hTLR4蛋白、HMGB1蛋白、P-IκB-α蛋白條帶灰度值分析Westernblot法檢測(cè)各組海馬TLR4蛋白、HMGB1蛋白、P-IκB-α蛋白表達(dá) SE后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)模型Ⅰ組與Ⅱ組海馬TLR4蛋白與P-IκB-α蛋白表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，與對(duì)照組比較，模型組HMGB1蛋白各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量無(wú)顯著性增加；SE后3 h模型Ⅱ組TLR4蛋白表達(dá)量顯著高于Ⅰ組，SE后24 h無(wú)顯著性差異；SE后3 h、24 h 模型Ⅱ組P-IκB-α蛋白表達(dá)量顯著高于Ⅰ組；模型Ⅰ組、Ⅱ組HMGB1蛋白表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1、表5。

圖1 各組SE后3 h、24 hTLR4蛋白、HMGB1蛋白、P-IκB-α蛋白、β-actin蛋白表達(dá)情況

組別TLR4PIκBαHMGB1對(duì)照組0.16±0.0750.62±0.0230.333±0.95模型Ⅰ組(3h)0.61±0.032d10.87±0.021e10.41±0.93f1模型Ⅰ組(24h)0.55±0.112d21.42±0.031e20.31±0.99f2模型Ⅱ組(3h)0.84±0.086d3,g11.32±0.044e3,g30.37±0.99f3,g5模型Ⅱ組(24h)0.63±0.094d4,g22.13±0.035e4,g40.40±0.98f4,g6F值11.38488.3440.567P值<0.01<0.01>0.05

注：SE：癲癇持續(xù)狀態(tài)，TLR4：Toll樣受體4，P-IκB-α：磷酸化核因子抑制蛋白α，HMGB1：高遷移率族蛋白1，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，與生理鹽水比較：t=7.804，d1P<0.05，t=4.256，d2P<0.05，t=8.385，d3P<0.05，t=4.262，d4P<0.05；t=4.383，e1P<0.05，t=14.521，e2P<0.05，t=6.627，e3P<0.05，t=19.458，e4P<0.05；t=0.389，f1P>0.05，t=0.106，f2P>0.05，t=0.213，f3P>0.05，t=0.279，f4P>0.05。與模型Ⅰ組比較：t=4.284，g1P<0.05，t=0.737，g2P>0.05，t=4.249，g3P<0.05，t=9.120，g4P<0.05，t=0.168，g5P>0.05，t=0.385，g6P>0.05

3 討論

近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)和臨床研究提示，炎癥反應(yīng)可能參與癲癇的發(fā)生發(fā)展，但大多數(shù)數(shù)據(jù)來(lái)源于成年癲癇患者或成年嚙齒動(dòng)物，對(duì)兒童癲癇患者或幼年動(dòng)物的研究較少。腦內(nèi)炎癥反應(yīng)與癲癇發(fā)作可能互為因果關(guān)系：(1)癲癇發(fā)作和繼發(fā)細(xì)胞損傷可引發(fā)炎癥反應(yīng)；(2)炎癥反應(yīng)可能促進(jìn)癲癇發(fā)作；(3)炎癥反應(yīng)可能參與癲癇發(fā)作后持久的細(xì)胞損傷[2-6]。針對(duì)炎癥反應(yīng)的治療方法對(duì)一些難治性癲癇及癲癇持續(xù)狀態(tài)的治療效果也優(yōu)于傳統(tǒng)抗癲癇藥[6]。LPS也稱(chēng)內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分之一，能被TLR4識(shí)別并激活膠質(zhì)細(xì)胞的固有免疫反應(yīng)。TLR4是第一種被認(rèn)為識(shí)別病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)的受體，LPS可以被TLR4識(shí)別引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，從而抵抗病原體入侵[7-8]。張艷祥等[9]通過(guò)海馬內(nèi)注射LPS誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作，且通過(guò)LPS活化TLR4可以加重鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)。HMGB1是一種核染色質(zhì)成分，正常生理情況下存在于細(xì)胞核中，死亡的細(xì)胞釋放的HMGB1被視為組織損傷的信號(hào)，可被TLR4識(shí)別并激活固有免疫反應(yīng)。HMGB1引發(fā)的免疫反應(yīng)與外源性病原體入侵時(shí)相似，但分子機(jī)制仍未明確[7，10-12]。正常生理?xiàng)l件下活化核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factor-κ-genebinding，NF-κB)與調(diào)節(jié)蛋白κB抑制劑(IκB-α)結(jié)合，以失活狀態(tài)存在于胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到TNF-α、LPS或吸入性麻醉劑等一系列外源性刺激時(shí)，TLR4/HMGB1信號(hào)通路依賴(lài)MyD88活化NF-κB，活化的NF-κB轉(zhuǎn)移入核并促進(jìn)炎癥介質(zhì)表達(dá)[13-14]。本研究在KA誘導(dǎo)幼年大鼠癲癇發(fā)作前2 h給予LPS預(yù)處理，檢測(cè)急性期海馬組織中TLR4、HMGB1基因及蛋白、P-IκB-α蛋白表達(dá)水平，探討TLR4/HMGB1/IκB-α在LPS加重幼年大鼠癲癇發(fā)作中的變化。

在癲癇小鼠模型和人類(lèi)顳葉癲癇、Rasmussen腦炎的研究中發(fā)現(xiàn)，TLR4/HMGB1通路在癲癇慢性病程中可以促進(jìn)驚厥發(fā)作[15-18]，也參與膠質(zhì)瘤相關(guān)癲癇的發(fā)生機(jī)制[19-20]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)癲癇患兒血清中HMGB1等炎癥因子水平升高[16，21-24]。HMGB1作為一種損傷相關(guān)分子模式(Damage-associated molecular patterns，DAMPs)，正常情況下存在于胞核中，當(dāng)組織損傷時(shí)由死亡的細(xì)胞釋放到胞外。研究發(fā)現(xiàn)，海人酸誘導(dǎo)的癲癇細(xì)胞模型中，HMGB1可以通過(guò)改變表達(dá)量和細(xì)胞分布位置，參與癲癇發(fā)生的病理生理學(xué)過(guò)程[12，25]，但是并未闡述具體機(jī)制及相關(guān)的信號(hào)通路。本研究發(fā)現(xiàn)LPS預(yù)處理可以增加KA造模的成功率及模型鼠的病死率，癲癇急性期海馬TLR4、HMGB1的基因表達(dá)均顯著增加，TLR4、P-IκB-α蛋白表達(dá)亦顯著增加，但HMGB1總蛋白無(wú)顯著改變；而LPS預(yù)處理可顯著增加TLR4、P-IκB-α蛋白的表達(dá)，對(duì)HMGB1的基因水平及蛋白表達(dá)無(wú)顯著性影響。提示LPS預(yù)處理使TLR4表達(dá)量升高，通過(guò)增加IκB-α磷酸化，在LPS預(yù)處理的幼鼠中促進(jìn)癲癇發(fā)作急性期腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加重癲癇發(fā)作。

TLR4/HMGB1信號(hào)通路可能促進(jìn)驚厥的發(fā)生和持續(xù)，或許可作為治療靶點(diǎn)改善難治性癲癇患者的治療效果[8，11，26]。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制HMGB1/TLR4信號(hào)通路可以減輕癲癇發(fā)作對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥損傷[27]，對(duì)難治性癲癇有一定的治療效果，也可抑制自身免疫性腦脊髓炎相關(guān)的癲癇[26，28-29]。但是由于炎癥網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，需要注意一系列炎癥因子的相互作用[30]。未來(lái)需要更多研究針對(duì)多種關(guān)鍵促炎因子聯(lián)合治療，以全面抑制炎癥網(wǎng)絡(luò)，可能達(dá)到更加一致的治療結(jié)果。本研究結(jié)果提示、癲癇發(fā)作引起的損傷細(xì)胞釋放HMGB1可以活化TLR4受體，通過(guò)磷酸化IκB-α活化下游炎癥反應(yīng)，LPS預(yù)處理可以加強(qiáng)這一現(xiàn)象從而加重癲癇發(fā)作，提示抑制TLR4活性或者抑制IκB-α磷酸化或許可以減輕癲癇發(fā)作引起的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而為尋找針對(duì)病因治療的新型抗癲癇藥物提供理論依據(jù)。

[1] RACINE R J.Modification of seizure activity by electri-cal stimulation.II.Motor seizure[J].Electroencephalogr Clin Neurophysiol，1972，32(3)：281-294.

[2] 張靜，禚志紅，王懷立.脂多糖預(yù)處理對(duì)癲癇幼鼠Toll樣受體4/高遷移率族蛋白1基因表達(dá)及海馬硬化的影響[J].中華實(shí)用兒科臨床雜志，2016，31(21)：1 658-1 662.

[3] DUPUIS N，AUVIN S.Inflammation and epilepsy in the developing brain：clinical and experimental evidence[J].CNS Neurosci Ther，2015，21(2)：141-151.

[4] LEGIDO A，KATSETOS C D.Experimental studies in epilepsy：immunologic and inflammatory mechanisms[J].Semin Pediatr Neurol，2014，21(3)：197-206.

[5] VEZZANI A，VIVIANI B.Neuromodulatory properties of inflammatory cytokines and their impact on neuronal excitability[J].Neuropharmacology，2015，96(Pt A)：70-82.

[6] MARCHI N，GRANATA T，JANIGRO D.Inflamma-tory pathways of seizure disorders[J].Trends Neurosci，2014，37(2)：55-65.

[7] BIANCHI M E，MANFREDI A A.Dangers In and Out[J].Science，2009，323(5 922)：1 683-1 684.

[8] FALIP M，SALAS-PUIG X，CARA C.Causes of CNS inflammation and potential targets for anticonvulsants[J].CNS Drugs，2013，27(8)：611-623.

[9] 張艷祥，遲兆富，劉學(xué)伍，等.海馬內(nèi)注射脂多糖導(dǎo)致癇性發(fā)作及其機(jī)制[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012，50(9)：1-5.

[10] MISKIN C，HASBANI D M.Status epilepticus：immunologic and inflammatory mechanisms[J].Semin Pediatr Neurol，2014，21(3)：221-225.

[11] MATIN N，TABATABAIE O，F(xiàn)ALSAPERLA R，et al.Epilepsy and innate immune system：A possible immunogenic predisposition and related therapeutic implications[J].Hum Vaccin Immunother，2015，11(8)：2 021-2 029.

[12] HUANG J S，WU Y，HUANG Q，et al.Expression level and distribution of HMGB1 in Sombati's cell model and kainic acid-induced epilepsy model[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2015，19(15)：2 928-2 933.

[13] LUO L，JIN Y，KIM I D，et al.Glycyrrhizin suppresses HMGB1 inductions in the hippocampus and subsequent accumulation in serum of a kainic acid-induced seizure mouse model[J].Cell Mol Neurobiol，2014，34(7)：987-997.

[14] WANG D，SHI J，LV S，et al.Artesunate Attenuates Lipopolysaccharide-Stimulated Proinflammatory Responses by Suppressing TLR4，MyD88 Expression，and NF-kappaB Activation in Microglial Cells[J].Inflammation，2015，38(5)：1 925-1 932.

[15] VEZZANI A.Epilepsy and inflammation in the brain：overview and pathophysiology[J].Epilepsy Curr，2014，14(1 Suppl)：3-7.

[16] YANG W，LI J，SHANG Y，et al.HMGB1-TLR4 Axis Plays a Regulatory Role in the Pathogenesis of Mesial Temporal Lobe Epilepsy in Immature Rat Model and Children via the p38MAPK Signaling Pathway[J].Neurochem Res，2017，42(4)：1 179-1 190.

[17] LUAN G，GAO Q，ZHA F，et al.Upregulation of HMGB1，toll-like receptor and RAGE in human Rasmussen's encephalitis[J].Epilepsy Res，2016，123：36-49.

[18] 李曉輝，王新軍，楊如意，等.顳葉難治性癲癇患者致癇灶腦組織中HMGB1、TLR4表達(dá)及意義[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2016，32(19)：3 223-3 227.

[19] 周少龍，王新軍，付旭東，等.伴有癲癇的人腦膠質(zhì)瘤中HMGB1/TLR4的表達(dá)研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2015，14(6)：563-566.

[20] 王新軍，楊如意，單嶠，等.人腦膠質(zhì)瘤組織HMGB1表達(dá)與膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇關(guān)系的探討[J].中華腫瘤防治雜志，2015，22(15)：1 180-1 183.

[21] 王懷立，郭慶敏，禚志紅，等.癲(癇)患兒血清高遷移率族蛋白1及白細(xì)胞介素-6水平變化的意義[J].中華實(shí)用兒科臨床雜志，2015，30(22)：1 738-1 740.

[22] 桂蘭，康靖，呂麗英.癲癇患兒血清HMGB1、IL-2、INF-γ 水平變化及其意義[J].山東醫(yī)藥，2017，57(11)：60-62.

[23] 郭電渠，王新軍，楊如意，等.癲癇患者血清HMGBI及其受體TLR4水平及臨床意義分析[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2016，15(9)：936-940.

[24] WALKER L E，F(xiàn)RIGERIO F，RAVIZZA T，et al.Molecular isoforms of high-mobility group box 1 are mechanistic biomarkers for epilepsy[J].J Clin Invest，2017，127(6)：2 118-2 132.

[25] KANEKO Y，PAPPAS C，MALAPIRA T，et al.Extracellular HMGB1 Modulates Glutamate Metabolism Associated with Kainic Acid-Induced Epilepsy-Like Hyperactivity in Primary Rat Neural Cells[J].Cell Physiol Biochem，2017，41(3)：947-959.

[26] MAROSO M，BALOSSO S，RAVIZZA T，et al.Toll-like receptor 4 and high-mobility group box-1 are involved in ictogenesis and can be targeted to reduce seizures[J].Nat Med，2010，16(4)：413-419.

[27] 金玉玲，單鶴，劉蕾.吡格列酮對(duì)戊四氮致癇大鼠Toll樣受體、核因子-κB表達(dá)的影響[J].中國(guó)老年學(xué)，2016，36(16)：3 890-3 893.

[28] RAVIZZA T，TERRONE G，SALAMONE A，et al.High Mobility Group Box 1 is a novel pathogenic factor and a mechanistic biomarker for epilepsy[J].Brain Behav Immun，2017 Oct 13.pii：S0889-1591(17)30464-6.

[29] LIU A H，WU Y T，WANG Y P.MicroRNA-129-5p inhibits the development of autoimmune encephalomye-litis-related epilepsy by targeting HMGB1 through the TLR4/NF-kB signaling pathway[J].Brain Res Bull，2017，132：139-149.

[30] DEY A，KANG X，QIU J，et al.Anti-Inflammatory Small Molecules To Treat Seizures and Epilepsy：From Bench to Bedside[J].Trends Pharmacol Sci，2016，37(6)：463-484.