韓一林，王鑫朝，許馨露，高 巖，溫國勝，張汝民，王玉魁

（1.國家林業(yè)局 竹子研究開發(fā)中心 浙江省竹子高效加工重點實驗室，浙江 杭州310012；2.浙江農(nóng)林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室,浙江 杭州311300）

在氣候變暖的背景下，高溫和干旱等災害天氣出現(xiàn)更為頻繁。溫度和水分作為全球氣候變化的兩大重要表征，是影響植物生長和分布的最重要的非生物因素［1］。兩者獨立或交互作用，都會對植物生長發(fā)育產(chǎn)生極大影響［2］。 活性氧（ROS）如過氧化氫（H2O2）， 超氧陰離子（O2·-）， 羥自由基（·OH）和單線態(tài)氧（1O2）等，是植物中氧化還原級聯(lián)的有氧代謝產(chǎn)物，如果不能被及時清除，將產(chǎn)生很強的氧化性，導致細胞脂質(zhì)過氧化，對細胞的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等生物大分子產(chǎn)生永久性傷害，進而引起細胞死亡［3］。此外，隨著ROS的積累，生物膜不飽和脂肪酸分解產(chǎn)生的丙二醛（MDA）［4］，一方面加劇細胞質(zhì)膜過氧化程度，導致膜系統(tǒng)損傷，使細胞受到傷害［5］；另一方面植物細胞產(chǎn)量顯著減少，最終引起機體衰老［6］。植物處于逆境下并不是被動承受傷害，而是主動調(diào)節(jié)適應。植物在進化過程中形成了相應的酶促保護系統(tǒng)［如超氧化物歧化酶（SOD），過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等］，能有效清除ROS，提高植物耐受能力［7］。 RAMíREZ等［8］研究發(fā)現(xiàn)， 擬南芥Arabidopsis thaliana通過維持體內(nèi)非酶系統(tǒng)［抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)］快速有效運轉，減輕逆境脅迫下植物的活性氧傷害，使植物更好地適應環(huán)境。學者對單一逆境脅迫條件下植物抗氧化防御系統(tǒng)的研究已有報道，并被認為是一個能夠反映植物抗性大小的普遍標記［2，9］，但是高溫干旱復合脅迫對抗氧化防御系統(tǒng)的研究較為少見。毛竹Phyllostachys edulis在中國分布極廣，具有重要的社會、經(jīng)濟和生態(tài)價值［10］。目前，針對毛竹抗逆性的研究主要集中在光合作用［11］、生長形態(tài)［12］和單一逆境下的抗氧化酶活性［13］等方面。本研究以毛竹為研究對象，通過設置高溫與干旱脅迫不同水平的處理，分析高溫和干旱疊加條件下毛竹體內(nèi)ROS的產(chǎn)生情況，探討抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)抵御氧化脅迫的變化規(guī)律，揭示高溫和干旱雙重脅迫下毛竹生理生化響應機制及其抗高溫和干旱的能力，為毛竹林培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料處理

試驗材料為3年生毛竹實生苗，苗高為1.0 m左右。于2015年8月下旬，選取生長良好形態(tài)相近的毛竹幼苗移栽于塑料花盆中（花盆高為50.0 cm，內(nèi)徑為60.0 cm），取浙江臨安當?shù)氐狞S壤土作為栽培土壤，pH 6.9～7.0，1株·盆-1，在緩苗期間，用自來水澆灌。選取生長良好，無病蟲害，長勢相近的毛竹25盆，其中對照組10盆，其余隨機分成3組（處理），5盆·組-1（重復），在常溫條件下（25℃/20℃，晝/夜）栽培。將對照組中的10盆隨機分為2組，5盆·組-1，其中1組作為干旱處理的對照組，正常管理，另一組作為高溫處理組，正常管理。

干旱處理：在緩苗30 d后進行。設計4個梯度的處理：對照70.0%～80.0%田間持水量（FC），輕度干旱（60.0%～70.0%FC）， 中度干旱（40.0%～50.0%FC）和重度干旱（20.0%～30.0%FC）。 采用稱量法控制土壤水分含量，每天17：00-18：00稱量并補充消耗的水分，干旱處理10 d。選取毛竹植株中上部完整的功能葉片取樣，樣品用液氮迅速冷凍，置于-80℃低溫冰箱內(nèi)保存。溫度處理：在8：00時將其中1組對照組和干旱處理過的毛竹盆栽苗放入40℃/30℃（晝/夜）人工氣候箱，設定晝夜相隔時間12 h，光照強度設定為400 μmol·m-2·s-1，高溫處理48 h后取毛竹植株中上部完整的功能葉片進行相關指標測定。

1.2 測試方法

1.2.1 O2·-，過氧化氫和MDA測定 O2·-測定參照SHAH等［14］的方法并略作改進：取0.2 g冷凍樣品，加5.0 mL磷酸緩沖液（100.0 mmol·L-1，pH 7.2， 含1.0 mmol·L-1二乙基二硫代氨基甲酸鈉）研磨， 15 000 g離心30 min（4℃）。3.0 mL反應體系包含：2.0 mL樣品提取液和1.0 mL氮藍四唑（NBT，0.25 mmol·L-1），在540 nm處測定3 min內(nèi)吸光度的變化。 結果表示為ΔD（540）·min-1·g-1。 過氧化氫測定參照 RAI等［15］的方法并略作改進：取0.2 g冷凍樣品，加5.0 mL磷酸緩沖液（50.0 mmol·L-1，pH 6.5）磨碎，3.0 mL樣品提取液與體積分數(shù)為20%的硫酸（含質(zhì)量分數(shù)為0.1%硫酸鈦）1.0 mL混合，16 000 g離心15 min（4℃），取上清液測定410 nm處的吸光度。過氧化氫的質(zhì)量摩爾濃度用吸光系數(shù)0.28 μmol-1·cm-1來計算，結果表示為 μmol·g-1。 MDA 測定參照 HODGES 等［16］的方法。

1.2.2 抗氧化酶活性測定 取0.2 g冷凍樣品液氮研磨，加5.0 mL磷酸緩沖溶液（50.0 mmol·L-1，pH 7.8）勻漿，10 000 g離心10 min（4℃）。上清液用于SOD，POD和CAT活性的測定。SOD活性測定參照GIANNOPOLITIS等［17］的方法。POD活性測定參照KUMARI等［18］的愈瘡木酚法。CAT活性測定參照KUMARI等［18］的方法。

1.2.3 AsA和GSH測定 取0.2 g冷凍樣品液氮研磨，加50.0 g·L-1偏磷酸5.0 mL勻漿，15 000 g離心15 min（4℃），上清液用于AsA和GSH的測定。AsA和GSH測定參照RAI等［19］的方法。

1.2.4 AsA-GSH循環(huán)相關酶活性測定 取0.2 g樣品用5.0 mL磷酸緩沖溶液（pH 7.4，含1.0 mmol·L-1乙二胺四乙酸EDTA）冰浴研磨成勻漿，混勻后在16 000 g離心20 min（4℃）。上清液為毛竹AsA-GSH循環(huán)的相關酶活性測定的酶液。抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定參照NAKANO等［20］的方法。谷胱甘肽還原酶（GR）活性測定參照SCHAEDLE等［21］的方法。單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性測定參照HOSSAIN 等［22］的方法。 脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性測定參照 DOULIS等［23］的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分為2組進行統(tǒng)計分析：一組為干旱脅迫處理，另一組為高溫干旱脅迫處理，高溫對照組即高溫處理組，所有的數(shù)據(jù)均取5次重復的平均值±標準誤。各組的數(shù)據(jù)利用Origin 9軟件（美國Origin Lab公司）進行統(tǒng)計分析和作圖。統(tǒng)計方法采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行檢驗，并進行Turkey多重比較。采用雙因素方差分析（two-way ANOVA）評估高溫脅迫×干旱脅迫的協(xié)同作用。

2 結果與分析

2.1 O2·-， 過氧化氫和 MDA 變化

隨干旱脅迫程度的增加毛竹葉片中的O2·-，過氧化氫和MDA質(zhì)量摩爾濃度逐漸上升（表1），其中在輕度干旱脅迫條件下，O2·-和MDA質(zhì)量摩爾濃度分別比對照高39.9%和68.8%（P＜0.01）；中度干旱脅迫時，O2·-，MDA和過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度分別比對照高74.4%，94.5%和38.8%（P＜0.01）。在高溫脅迫條件下，O2·-，過氧化氫和MDA質(zhì)量摩爾濃度分別比對照高44.2%，21.9%和140.9%（P＜0.01）。在協(xié)同脅迫下，三者質(zhì)量摩爾濃度進一步增加，在輕度干旱和高溫協(xié)同脅迫下，O2·-，過氧化氫和MDA質(zhì)量摩爾濃度分別比對照高67.6%，28.8%和170.5%（P＜0.01）。

2.2 SOD，POD與CAT活性變化

隨干旱脅迫程度的增加，毛竹葉片的SOD，POD和CAT活性均逐漸增加（圖1）。中度干旱脅迫下，SOD和POD活性分別比對照高1.7倍和1.7倍（P＜0.01）；輕度干旱脅迫下，CAT活性比對照高1.9倍（P＜0.05）。在高溫脅迫條件下，SOD，POD和CAT活性分別比對照高0.8倍、0.6倍和1.6倍，三者活性與其對照的差異均極顯著（P＜0.01）。協(xié)同脅迫使SOD和POD活性呈先增加后降低，且均在中度干旱水平的協(xié)同脅迫下達到峰值，分別比對照高2.9倍和3.2倍（P＜0.01）；CAT活性呈逐漸增加趨勢，在中度干旱和高溫協(xié)同脅迫下與對照的差異極顯著（P＜0.01）。

表1 干旱和高溫脅迫對毛竹活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的影響Table 1 Effects of high temperature and drought stress on ROS and MDA contents in Phyllostachys edulis

2.3 抗氧化物的變化

隨干旱脅迫程度的增加，毛竹葉片的AsA和二十二碳六烯酸（DHA）質(zhì)量摩爾濃度均呈逐漸上升趨勢（圖2），在中度干旱時AsA質(zhì)量摩爾濃度比對照高49.5%（P＜0.01）；在輕度干旱時DHA質(zhì)量摩爾濃度比對照高30.6%（P＜0.01）；ρAsA/ρDHA呈先下降后上升，在輕度干旱時達到最小值，比對照降低13.9%（P＞0.05）。在高溫條件下，AsA質(zhì)量摩爾濃度和ρAsA/ρDHA分別比對照高55.6%和34.1%（P＜0.01）；DHA質(zhì)量摩爾濃度比對照高15.6%（P＜0.05）。協(xié)同脅迫下，三者變化均不大：其中AsA質(zhì)量摩爾濃度呈先增加后降低，在中度干旱和高溫的協(xié)同脅迫時達最大值，比對照高72.9%（P＜0.01），隨后降低；DHA質(zhì)量摩爾濃度總體變化不大，輕度干旱和高溫協(xié)同脅迫時，比對照高22.3%（P＜0.05），其他變化不顯著；ρAsA/ρDHA變化不大，在輕度干旱和高溫協(xié)同脅迫時達最大值，比對照高37.3%（P＜0.01）。

在干旱脅迫條件下，毛竹葉片的還原型谷胱甘肽（GSH）質(zhì)量摩爾濃度變化與對照差異不顯著（P＞0.05）（圖3）；氧化型谷胱甘肽（GSSG）質(zhì)量摩爾濃度呈下降趨勢，中度干旱脅迫時其質(zhì)量摩爾濃度比對照降低30.6%（P＜0.01）；ρGSH/ρGSSG呈上升趨勢，中度干旱比對照高55.3%（P＜0.01）。在高溫脅迫及協(xié)同脅迫下，三者的變化與對照比較均不顯著（P＞0.05）。

2.4 AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)相關酶活性變化

隨干旱脅迫程度的增加，毛竹葉片的APX酶活性先逐漸增加后變化緩慢（圖4），在中度干旱脅迫下達到最大值，比對照高1.8倍（P＜0.01）；GR和MDHAR活性均呈上升趨勢，輕度干旱脅迫時其活性分別比對照高0.7倍和0.9倍（P＜0.01）；DHAR活性先增加后降低，中度干旱脅迫時達到最大值，比對照高2.3倍（P＜0.01）。高溫脅迫時，APX活性比對照高0.3倍（P＜0.05）；而GR，MDHAR和DHAR活性分別比對照高0.9倍、1.1倍和0.6倍（P＜0.01）。在高溫的基礎上，隨著干旱脅迫程度的加深，四者活性均呈先增加后降低，APX和GR活性增加緩慢，MDHAR和DHAR活性增加迅速，中度干旱和高溫協(xié)同脅迫時均達到最大值，分別比對照高1.2倍、1.9倍、3.9倍和1.9倍（P＜0.01），隨后降低。

3 討論

細胞膜對維持細胞正常生命活動具有至關重要的作用，而O2·-和過氧化氫是植物代謝過程中產(chǎn)生的2種活性氧，對細胞膜脂質(zhì)具有較強的氧化傷害作用；MDA作為膜脂過氧化作用的終極產(chǎn)物，其變化可解釋逆境脅迫對植物細胞膜的破壞程度及植物對逆境的響應［24］。本試驗結果表明：干旱脅迫下，毛竹葉片中的O2·-和MDA產(chǎn)生速率明顯增加，而高溫脅迫下，過氧化氫、O2·-和MDA產(chǎn)生速率增加均極顯著，且高溫時MDA質(zhì)量摩爾濃度較中度干旱脅迫顯著增加。這與吳永波等［2］的研究結果不一致，表明高溫比干旱對毛竹的影響更大，可能是在不同溫度和水分條件下，不同植物體內(nèi)活性氧對植物產(chǎn)生的傷害程度不同導致的。協(xié)同脅迫下，隨著干旱程度的增加，三者質(zhì)量摩爾濃度逐漸增加，且在同等干旱程度下，高溫條件下的O2·-和MDA質(zhì)量摩爾濃度均比正常溫度下的質(zhì)量摩爾濃度顯著升高，表明協(xié)同脅迫較單一脅迫對毛竹傷害更大，可能協(xié)同脅迫已經(jīng)傷害到抗氧化物質(zhì)產(chǎn)生的機構，削弱了對氧化物質(zhì)的清除作用，導致氧化物質(zhì)不斷累積。

毛竹處于逆境中，不僅體內(nèi)過氧化氫、O2·-和MDA的產(chǎn)量大量增加，還刺激抗氧化酶活性增強。SOD，POD和CAT是植物抗氧化系統(tǒng)重要組成部分［25］。其中SOD是抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，可以使植物體內(nèi)過量的O2·-發(fā)生歧化反應，生成過氧化氫（H2O2）和氧氣（O2）；POD和CAT與SOD具有協(xié)同作用，將其氧化產(chǎn)生的H2O2和具有潛在危害的O2·-轉化為水和氧氣，從而阻止O2·-和過氧化氫在植物體內(nèi)的累積，減少對植物體的傷害。本研究發(fā)現(xiàn)：隨干旱高溫脅迫程度的增加，毛竹葉片產(chǎn)生過量的ROS，且抗氧化酶活性升高。說明O2·-質(zhì)量摩爾濃度增加，它的積累刺激葉片中SOD應激反應使活性增強，催化O2·-歧化生產(chǎn)基態(tài)分子氧和過氧化氫；毛竹葉片中的過氧化氫和MDA逐漸增加，由于POD和CAT的作用，其質(zhì)量摩爾濃度增幅緩慢；而在重度干旱和高溫協(xié)同脅迫下，SOD和POD活性較中度干旱和高溫協(xié)同脅迫顯著降低，CAT活性降低不明顯，可能是SOD活性表達受到抑制，且過度脅迫導致一部分已經(jīng)表達的SOD失活［26］造成的，而POD和CAT酶活性分別在高溫干旱前期和后期對過氧化氫清除起主導作用［27］，表明在持續(xù)時間較長的高溫干旱條件下，CAT效率更高，耐性更穩(wěn)定?？傊?，在單一脅迫條件時，毛竹在抗氧化酶防御系統(tǒng)作用下，能有效消除因高溫干旱脅迫積累的ROS，使過氧化氫、O2·-和MDA質(zhì)量摩爾濃度增幅減緩，表明一方面脅迫條件下毛竹體內(nèi)產(chǎn)生的ROS能夠對毛竹產(chǎn)生傷害，另一方面毛竹在遇到脅迫會刺激抗氧化酶活性增加，有效清除ROS，維持毛竹體內(nèi)活性氧平衡，防止氧化傷害，適應環(huán)境變化。而在協(xié)同脅迫條件時，過氧化氫、O2·-和MDA質(zhì)量摩爾濃度顯著增加，SOD，POD和CAT活性有降低趨勢，表明協(xié)同脅迫比單一脅迫對植物造成的傷害更大。

圖1 不同處理毛竹葉片抗氧化酶活性變化Figure 1 Changes of antioxidant enzyme activities in Phyllostachys edulis under different treatments

AsA-GSH循環(huán)是植物體內(nèi)清除自由基的重要途徑。AsA不僅可以直接清除活性氧，在AsA-GSH循環(huán)清除過氧化氫過程中也發(fā)揮著重要作用［27］。APX是以AsA為電子供體的一種過氧化物酶，能夠快速清除細胞中產(chǎn)生的過量的過氧化氫，是植物體內(nèi)尤其是葉綠體中清除過氧化氫的關鍵酶［28］；植物通過維持較高的ρAsA/ρDHA和ρGSH/ρGSSG比值，使植物體內(nèi)抗壞血酸庫和谷胱甘肽庫保持較高的還原態(tài)［29-30］。本研究結果表明：在單一脅迫下，毛竹葉片產(chǎn)生過量的H2O2，AsA和DHA質(zhì)量摩爾濃度隨之增加，一方面直接消除過氧化氫降低傷害；另一方面通過AsA-GSH循環(huán)清除過氧化氫。但輕度干旱脅迫下，ρAsA/ρDHA比值最低，可能是由于干旱脅迫初期，毛竹葉片產(chǎn)生過量的過氧化氫，AsA清除過氧化氫有所消耗，而AsA-GSH循環(huán)不能及時補充AsA，使得ρAsA/ρDHA比值降低；隨脅迫程度增強，毛竹適應此逆境后，AsAGSH循環(huán)達到一個新的穩(wěn)態(tài)，及時補充AsA的損失，維持較高的ρAsA/ρDHA比值，抵抗氧化脅迫；同時，GSH質(zhì)量摩爾濃度變化較對照不明顯，GR活性增加，與GSSG質(zhì)量摩爾濃度變化相反，說明GR在還原型煙酰胺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的作用下，加速催化GSSG還原成GSH，使毛竹葉片中的ρGSH/ρGSSG比值增加，維持植物體內(nèi)較高的還原態(tài)，減緩毛竹氧化傷害。這與楊穎麗等［31］研究結果一致。在干旱和高溫協(xié)同脅迫下，AsA，DHA，GSH和GSSH質(zhì)量摩爾濃度變化不大，而APX，MDHAR，DHAR和GR活性先增加后降低，均在中度干旱和高溫協(xié)同脅迫時達到峰值，這是因為在AsA-GSH循環(huán)中，毛竹受到較強程度協(xié)同脅迫的刺激，使葉片中清除過氧化氫的APX和加快AsA循環(huán)再生的MDHAR和DHAR活性的增加，加快AsA和DHA大量快速生成，及時補充AsA清除過氧化氫的消耗；同時，毛竹葉片中GSSG在關鍵酶GR作用下催化產(chǎn)生GSH，DHAR利用GSH提供的電子供體將DHA還原成AsA，使AsA質(zhì)量摩爾濃度保持穩(wěn)定，進而促進AsA-GSH循環(huán)，使ρAsA/ρDHA比值維持在較強的還原性范圍內(nèi)，以利于抵御氧化脅迫；此時ρGSH/ρGSSG比值較為穩(wěn)定，說明GSH循環(huán)比AsA循環(huán)對過氧化氫的還原作用更為穩(wěn)定，清除過氧化氫的作用更為持久有效，因此GR作為AsA-GSH循環(huán)中最后一步關鍵酶，在毛竹抵抗高溫干旱脅迫中發(fā)揮重要作用。但在重度干旱和高溫協(xié)同脅迫下，APX，MDHAR，DHAR和GR活性降低，AsA質(zhì)量摩爾濃度隨之降低，導致ρAsA/ρDHA比值也略有降低，說明毛竹葉片在高強度的協(xié)同脅迫下，AsA-GSH循環(huán)中的酶受溫度和水分的影響，活性降低，此循環(huán)不能及時催化產(chǎn)生AsA，補充AsA清除過氧化氫產(chǎn)生的消耗，導致AsA-GSH循環(huán)效率降低，抵御逆境的能力降低。而DHA質(zhì)量摩爾濃度變化不大，這與MOSTOFA等［32］研究結果不一致，這可能是過度脅迫條件下，由于MDHA極不穩(wěn)定，既可還原成AsA，也可進一步歧化為DHA，又因為過多的DHA積累對細胞有害，所以MDHAR能限制MDHA產(chǎn)生以及進一步轉化為DHA；此外，由于DHAR活性降低，無法利用GSH提供的電子供體把DHA還原成AsA［33］，使得毛竹葉片中的AsA循環(huán)被打破，形成新的動態(tài)循環(huán)，也說明這些酶對脅迫的反應因物種而異。這也表明毛竹幼苗的AsA循環(huán)對逆境反應較GSH循環(huán)更敏感，而GSH循環(huán)在抵御逆境的能力更穩(wěn)定。

圖2 不同處理毛竹葉片抗壞血酸的變化Figure 2 Changes in the content of ascorbic acid in Phyllostachys edulis under different treatments

數(shù)據(jù)為平均值±標準誤（n=5）。根據(jù)Tukey檢驗（P＜0.05），同列不同大寫字母表示25℃時不同處理類型間差異顯著，同列不同小寫字母表示40℃時不同處理類型間差異顯著。Fs表示不同溫度間的差異；Fm表示不同處理類型的影響，F(xiàn)s×Fm表示植物組織應對高溫干旱脅迫的不同響應。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，ns表示差異不顯著

圖4 不同處理毛竹葉片AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)酶活性變化Figure 4 Changes of enzyme activities in AsA-GSH cycle system in Phyllostachys edulis under different treatments

4 結論

隨高溫干旱單一處理強度的增加，毛竹葉片中的過氧化氫、O2·-與MDA質(zhì)量摩爾濃度增加，且協(xié)同脅迫下，三者質(zhì)量摩爾濃度進一步增加，表明高溫干旱協(xié)同脅迫下較單一脅迫對毛竹傷害更大。干旱和高溫協(xié)同脅迫下，毛竹葉片內(nèi)抗氧化防御酶活性逐漸增強，且CAT清除過氧化氫較POD活性表現(xiàn)更為穩(wěn)定，說明在抗氧化酶系統(tǒng)中CAT清除過氧化氫效果更為持久，在協(xié)同脅迫后期對防御氧化傷害起到主要作用；AsA-GSH循環(huán)相關酶活性隨處理的增強而增加，通過AsA和GSH的再生，AsA-GSH循環(huán)動態(tài)平衡得以維持，有效消除過氧化氫，保護毛竹細胞不受損害，且在AsA-GSH循環(huán)中，ρGSH/ρGSSG比值較ρAsA/ρDHA比值更為穩(wěn)定，說明GSH循環(huán)清除過氧化氫比AsA循環(huán)的效果更為持久，對持續(xù)協(xié)同脅迫起到重要防御作用。但是在重度干旱和高溫協(xié)同脅迫下，毛竹葉片抗氧化防御酶活性和AsA-GSH循環(huán)相關酶活性均表現(xiàn)下降趨勢，說明毛竹的酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)對高溫干旱協(xié)同脅迫的抵御能力是有限的，在一定范圍內(nèi)可有效清除活性氧，超出一定范圍則降低。

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