汪清銳，呂林芳

(山西省桑干河楊樹豐產(chǎn)林實(shí)驗(yàn)局科技服務(wù)中心，山西 大同 037000)

三倍體歐洲山楊(TriploidPopulustremula)具有超速生性，但常規(guī)的扦插、嫁接繁殖方法容易傳染母株致病菌和病毒，不適合大規(guī)模的生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)。組織培養(yǎng)技術(shù)的建立能解決營(yíng)養(yǎng)繁殖速度慢、受季節(jié)限制的問(wèn)題。筆者采集三倍體歐洲山楊根萌生的幼苗莖段作為外植體，建立三倍體歐洲山楊組織培養(yǎng)體系。

1 材料和方法

1.1 外植體材料

三倍體歐洲山楊無(wú)性系是歐洲山楊花粉和來(lái)自加拿大的美洲山楊花粉雜交而來(lái)的，由原山西省中德林業(yè)技術(shù)合作項(xiàng)目從德國(guó)漢明登山楊家系林中引進(jìn)并培育。7月初，取三倍體歐洲山楊大田根萌生的幼苗莖段作為外植體材料。

1.2 消毒

由于使用的根萌生幼苗處于生長(zhǎng)旺盛季節(jié)，所攜帶的病菌較多。所以，應(yīng)對(duì)準(zhǔn)備接種的幼苗莖段進(jìn)行嚴(yán)格消毒。預(yù)處理：用軟刷在流水中清洗莖段表面約10 min，之后將莖段切成約10 cm長(zhǎng)的小段，剪去葉子留1 cm的葉柄，以便保護(hù)芽。用80 μmL/L青霉素加入數(shù)滴吐溫80浸泡半小時(shí)，并清洗。

消毒：在70%乙醇中浸泡20 s～30 s，用無(wú)菌水清洗2次。再用0.1% HgCI2或2.5% NaCIO消毒，之后用無(wú)菌水清洗5次(每次1 min左右)。根據(jù)消毒方法不同設(shè)3個(gè)處理，見表1.

表1 不同的消毒處理方法

1.3 接種

將莖段切成約1 cm長(zhǎng)帶芽小段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基TPTL：MS基本培養(yǎng)基(蔗糖濃度為30.0 g/L，瓊脂濃度為5.5 g/L，同下)+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，培養(yǎng)在光強(qiáng)度約為3 000 Lx，光周期為16 h，溫度為25 ℃的培養(yǎng)室中。

1.4 芽和幼苗的快繁

從外植體上誘導(dǎo)出的幼苗長(zhǎng)至2 cm～3 cm時(shí)，把其切成帶節(jié)間的小段接種到增殖培養(yǎng)基中，根據(jù)添加植物激素不同設(shè)4個(gè)處理，見表2.

每個(gè)小段在增殖培養(yǎng)基上可以分化成10倍以上的幼苗，約20 d可以繼代1次，這樣在生根培養(yǎng)以前可以使幼苗成指數(shù)增加。

1.5 生根培養(yǎng)

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好、直立，長(zhǎng)2 cm以上帶有2個(gè)～3個(gè)主要節(jié)間的幼苗用于生根培養(yǎng)。把選擇的幼苗接種到附加IBA的TPTR培養(yǎng)基(MS+0.1 mg/L IBA)上，培養(yǎng)15 d以上即可生根。通常生長(zhǎng)狀態(tài)不好、彎曲、微黃的幼苗較難生根。

2 結(jié)果與討論

2.1 外植體對(duì)芽誘導(dǎo)成功率的影響

研究發(fā)現(xiàn)，外植體的老嫩會(huì)影響芽的誘導(dǎo)成功率。7月份采集的根萌生幼苗莖段，幼嫩部分無(wú)法徹底消毒，全部污染。半木質(zhì)化莖段適宜作為外植體，可以徹底消毒而成活。根萌生的幼苗莖段經(jīng)消毒后接種在TPTL上，誘導(dǎo)率達(dá)98%.

2.2 消毒對(duì)芽誘導(dǎo)成功率的影響

三倍體歐洲山楊根萌生的幼苗莖段外植體較難消毒，攜帶內(nèi)生菌較多。如果用2.5% NaClO溶液進(jìn)行消毒，再生植株接種后3 d內(nèi)幾乎全部褐化爛掉，說(shuō)明三倍體歐洲山楊對(duì)NaClO溶液極其敏感。如果用HgCl2溶液消毒，莖段污染率為75%，但沒有褐化爛掉的現(xiàn)象。用3 g/L的多菌靈溶液浸泡半小時(shí)后清洗數(shù)次，之后幼苗莖段全部褐化爛掉，而半木質(zhì)化莖段部分成活。因此，應(yīng)避免用多菌靈對(duì)幼嫩外植體進(jìn)行浸泡清洗。

2.3 植物激素對(duì)芽分化的影響

將誘導(dǎo)出的小苗切成1 cm以上帶莖節(jié)的莖段，在不同的TPTS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能夠分化成芽簇。添加KT可以促進(jìn)芽大量分化，是三倍體歐洲山楊高倍數(shù)增殖的主要激素因子。GA3可以有效促進(jìn)莖節(jié)增長(zhǎng)，所以，最理想的分化增殖培養(yǎng)基為TPTS 3，增殖系數(shù)達(dá)到15.

2.4 植物激素對(duì)生根的影響

增殖培養(yǎng)基TPTS 3中的莖段，在未添加NAA和IBA的情況下，發(fā)生大量生根現(xiàn)象。說(shuō)明，三倍體歐洲山楊組培生根極其容易。生根配方中加入IBA，生根率可達(dá)90%.

3 結(jié)論

7月初取大田根萌生的幼苗，剪成莖段作為外植體材料，建立三倍體歐洲山楊組織培養(yǎng)快繁體系。將幼苗的莖段進(jìn)行嚴(yán)格消毒后再接種，可以取得理想結(jié)果。理想誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，試管苗增殖采用配方MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.3 mg/L GA3，增殖系數(shù)為15，生根配方采用MS+0.1 mg/L IBA.本研究結(jié)果可為三倍體歐洲山楊根萌生幼苗的組織培養(yǎng)墊定技術(shù)基礎(chǔ)。