羅 磊， 朱建鋒， 王蓓麗， 郭 瑋， 潘柏申

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032

EDTA依賴的假性血小板減少(EDTA-dependent pseudothrombocytopenia，EDTA-PTCP)是一種由EDTA鹽抗凝劑引起血小板聚集，導(dǎo)致血細(xì)胞自動(dòng)分析儀不能有效識(shí)別，從而產(chǎn)生血小板計(jì)數(shù)結(jié)果明顯低于正常值的現(xiàn)象[1]。EDTA-PTCP在門診患者中發(fā)生率為0.09%～0.11%[2]，住院患者中約1.9%[3]。目前，檢驗(yàn)科針對(duì)EDTA-PTCP的患者通常采用更換枸櫞酸鈉抗凝劑、添加氨基糖苷類藥物或人工血小板計(jì)數(shù)的方法來進(jìn)行復(fù)檢。然而，這些方法比較耗時(shí)、費(fèi)力，且更換抗凝劑和人工計(jì)數(shù)需要重復(fù)抽血，給患者造成了一定的痛苦。因此，本研究嘗試采用更為簡(jiǎn)便的震蕩法來解散EDTA引起的血小板聚集團(tuán)簇，糾正EDTA-PTCP，以期獲得可靠的血小板計(jì)數(shù)結(jié)果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年3月至2016年1月EDTA-PTCP患者140例。其中，男性68例，女性72例；年齡31～68歲，中位年齡為53歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：血常規(guī)檢測(cè)中僅血小板計(jì)數(shù)減少(<125×109/L)，其他參數(shù)均正常；儀器有報(bào)警提示血小板聚集，血涂片鏡檢確認(rèn)存在聚集現(xiàn)象；更換枸櫞酸鈉抗凝劑能糾正?；颊咂つw無紫癜，黏膜無出血，肝、脾、淋巴結(jié)未見腫大，除外其他引起血小板減少的疾病[4]。另隨機(jī)選擇20例血常規(guī)結(jié)果完全正常的標(biāo)本作為對(duì)照。

1.2 儀器與材料 采用Sysmex XE-2100全自動(dòng)血液分析儀及IKA○ RMS3圓周式震蕩儀；Sysmex XE-2100全自動(dòng)血液分析儀配套試劑、BD公司EDTA-K2及枸櫞酸鈉抗凝劑真空采血管；Sysmex XE-2100配套質(zhì)控e-CHECKTM。

1.3 檢測(cè)方法 EDTA-PTCP血標(biāo)本及正常血標(biāo)本用高速震蕩儀以3 000 r/min(r=4.5 mm)震蕩3 min后，立刻于Sysmex XE-2100全自動(dòng)血液分析儀上再次檢測(cè)，并制作血涂片2張用于顯微鏡下觀察血小板分布情況。顯微鏡下觀察時(shí)采用400倍高倍鏡(物鏡40倍×10倍目鏡)，瀏覽血涂片尾部、雙側(cè)及血細(xì)胞分布均勻區(qū)域，至少觀察10個(gè)視野，比較震蕩前后血小板計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果及血涂片中血小板分布情況。以鏡檢血小板分布情況作為判斷血小板聚集是否解散的標(biāo)準(zhǔn)。所有標(biāo)本在采集后30 min內(nèi)完成首次檢測(cè)，震蕩后再次檢測(cè)均在標(biāo)本采集當(dāng)天完成。

2 結(jié) 果

2.1 震蕩前后血小板計(jì)數(shù)及聚集情況比較 140例EDTA-PTCP血標(biāo)本震蕩前后，血小板計(jì)數(shù)分別為(6～118)× 109/L、(13～376)× 109/L，中位數(shù)分別為 47× 109/L、162× 109/L。震蕩法后鏡檢提示，93例完全解聚(圖1、圖2)、47例未完全解聚。

93例完全解聚標(biāo)本震蕩前后血小板計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；47例未完全解聚標(biāo)本震蕩前后血小板計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

圖1 93例震蕩后解聚EDTA-PTCP標(biāo)本震蕩前后血小板計(jì)數(shù)情況對(duì)比

圖2 震蕩后解聚EDTA-PTCP標(biāo)本震蕩前(A)、后(B)血涂片中血小板分布比較

標(biāo)本數(shù)血小板計(jì)數(shù)(×109/L)范圍中位數(shù)完全解聚(n=93) 震蕩前6～11833 震蕩后128～376184未完全解聚(n=47) 震蕩前8～9039 震蕩后13～14548

2.2 震蕩前后紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 140例EDTA-PTCP血標(biāo)本震蕩前后紅細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(4.62 ± 0.41)× 1012/L、(4.70 ± 0.44)× 1012/L，白細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(6.49 ± 1.64)× 109/L、(6.56 ± 1.68)× 109/L，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 正常血標(biāo)本震蕩前后比較 20例正常的血常規(guī)標(biāo)本震蕩前后血小板計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及血小板參數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 正常血標(biāo)本震蕩前后參數(shù)結(jié)果比較

PLT: 血小板計(jì)數(shù)；RBC：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)：WBC：白細(xì)胞計(jì)數(shù)；MPV：平均血小板體積；PDW：血小板分布寬度；PCT：血小板比積

3 討 論

EDTA-K2抗凝劑是引起假性血小板計(jì)數(shù)降低的主要原因之一[5]，已經(jīng)引起了檢驗(yàn)科的高度重視。全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀以其快速、簡(jiǎn)便、精密度好和準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)被臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛用于血液細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。然而，由于血小板計(jì)數(shù)分析原理(阻抗法)的局限性，當(dāng)血小板發(fā)生聚集時(shí)，體積遠(yuǎn)大于正常血小板，血細(xì)胞分析儀將其誤認(rèn)為白細(xì)胞計(jì)數(shù)，導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)結(jié)果假性降低，如不進(jìn)行鏡檢確認(rèn)和糾正，可能導(dǎo)致臨床誤診，使患者接受不必要且有創(chuàng)性治療，如輸注血小板、按照免疫性血小板減少癥進(jìn)行激素治療或進(jìn)行骨髓穿刺術(shù)。

目前，檢驗(yàn)科在遇到EDTA-PTCP患者時(shí)，通常采取的措施是重新采集經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝的血液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)或添加氨基糖苷類藥物進(jìn)行解聚。枸櫞酸鈉抗凝標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果需要進(jìn)行抗凝劑/血液標(biāo)本體積校正。有文獻(xiàn)[6]報(bào)道，枸櫞酸鈉抗凝血小板的穩(wěn)定性隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低，少數(shù)情況下使血小板發(fā)生聚集，造成假性血小板降低。而且重復(fù)采血不僅造成人力與時(shí)間的浪費(fèi)，還會(huì)給患者帶來痛苦。而添加氨基糖苷類藥物后，血小板聚集解離需要約30 min。而且，不同患者對(duì)氨基糖苷類藥物的敏感性不同，解聚效果不盡相同[7]，加之氨基糖苷類藥物會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞分類檢測(cè)通道溶血及染料結(jié)合效果不佳，從而導(dǎo)致分類計(jì)數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確。

本研究嘗試在避免重復(fù)抽血的基礎(chǔ)上，采用震蕩法快速處理EDTA-PTCP標(biāo)本，對(duì)該方法用于糾正EDTA-PTCP的可行性進(jìn)行了探討。結(jié)果顯示，93例(66.4%)標(biāo)本完全解聚，提示震蕩法能代替枸櫞酸鈉抗凝法用于EDTA-PTCP標(biāo)本解聚。震蕩法一定程度上減少了因重復(fù)抽血造成的人力與時(shí)間浪費(fèi)以及給患者帶來的痛苦，避免了臨床上因誤診血小板減少而進(jìn)行血小板輸注等的發(fā)生。

本研究中，有47例(33.6%)EDTA-PTCP標(biāo)本，震蕩法無法將其聚集的血小板完全解散，可能與EDTA-PTCP的發(fā)生機(jī)制有關(guān)。目前，對(duì)于EDTA-PTCP的機(jī)制尚未明確，通常認(rèn)為是一種免疫機(jī)制介導(dǎo)的現(xiàn)象，即體外血液中EDTA依賴性血小板自身抗體誘導(dǎo)血小板聚集。最早Pegels等[8]發(fā)現(xiàn)，血小板無力癥(Glanzmann病)無此現(xiàn)象發(fā)生，因該病患者血小板膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)Ⅱb/Ⅲa基因缺失，從而推測(cè)EDTA依賴性血小板自身抗體作用位點(diǎn)可能是GPⅡb/GPⅢa。研究[9]發(fā)現(xiàn)，發(fā)生EDTA-PTCP時(shí)，這種自身抗體主要作用于血GPⅡb。GPⅡb是一個(gè)Ca2+依賴蛋白質(zhì)，在Ca2+存在時(shí)與GPⅢa 組成異源二聚體；當(dāng)Ca2+濃度降低時(shí)，GPⅡb/Ⅲa二聚體解離，顯露出GPⅡb上的隱性表位。EDTA依賴性血小板自身抗體可能通過作用于這一隱性表位而引起血小板聚集。但部分情況下結(jié)合不牢固，可通過震蕩分散解離；對(duì)于無法震蕩解離的標(biāo)本，自身抗體可能介導(dǎo)了血小板的進(jìn)一步活化并促進(jìn)纖維蛋白的形成，進(jìn)而促進(jìn)聚集[10]。

綜上所述，本研究證實(shí)，震蕩法可使大部分EDTA-PTCP血標(biāo)本血小板解聚，有助于獲得準(zhǔn)確的血小板計(jì)數(shù)結(jié)果，同時(shí)不影響其他血細(xì)胞參數(shù)，是一種簡(jiǎn)單、有效的方法。而對(duì)于震蕩法無法糾正的標(biāo)本，可再采取更換抗凝劑或添加氨基糖苷類藥物等方法進(jìn)行解聚。

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