曾海英， 彭 睿， 黃曉勇， 張歆昱， 楊 軒， 陸佳成， 施國(guó)明， 柯愛(ài)武， 蔡加彬*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所，上海 200032

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)是上皮來(lái)源的惡性腫瘤，占原發(fā)性肝癌的4%～6%[1-2]。ICC發(fā)病隱匿、侵襲性高、易轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者預(yù)后不良[3]。目前早期ICC可手術(shù)切除，但其早期診斷及輔助治療仍較困難[4]。因此，尋找ICC的早期診斷指標(biāo)至關(guān)重要。

泛素化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)異常與腫瘤、炎癥等多種疾病密切相關(guān)[5-6]。E3泛素化連接酶UHRF2與多種腫瘤相關(guān)。UHRF2與細(xì)胞周期蛋白相關(guān)，并由此影響非小細(xì)胞肺癌的增殖[7-9]。近期研究[10-14]發(fā)現(xiàn)，UHRF2與DNA甲基化和組蛋白甲基化有關(guān)。UHRF2在肺癌[15]、結(jié)腸癌[16]及膠質(zhì)瘤[17]中的作用均有報(bào)道，但與ICC的關(guān)系尚不清楚。因此，本研究檢測(cè)了UHRF2在ICC患者癌組織中的表達(dá)，并評(píng)估其與ICC臨床病理因素的相關(guān)性及預(yù)后評(píng)估價(jià)值，為ICC患者臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本來(lái)源 選取2002年11月至2009年11月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院接受手術(shù)切除的138例ICC患者的癌組織石蠟切片。所有患者均有明確的病理診斷，并有完整的5年隨訪資料。本研究通過(guò)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化 組織芯片60℃烤片2 h，二甲苯脫蠟，分別用100%、95%、85%、75%乙醇水化。然后用甲醇過(guò)氧化氫溶液孵育30 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，高溫微波檸檬酸鈉溶液抗原修復(fù)15 min，5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h。加入U(xiǎn)HRF2一抗 (博士德，1∶1 000)，于4℃孵育過(guò)夜后，用磷酸鹽緩沖液洗去一抗，用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)室溫孵育1 h，DAB顯色，顯微鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)染色情況。染至深棕色用磷酸鹽緩沖液終止顯色，蘇木精復(fù)染30 s，水洗返藍(lán)10 min，然后用75%、85%、95%、無(wú)水乙醇逆濃度梯度脫水，二甲苯透明，風(fēng)干，中性樹膠封片保存。

UHRF2組化染色評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：選擇UHRF2表達(dá)的中間值作為截?cái)嘀?，以UHRF2陽(yáng)性染色區(qū)域≥50%時(shí)為UHRF2高表達(dá)[18-19]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier法；相關(guān)分析采用Cox回歸模型。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 UHRF2在ICC組織中的表達(dá) 138例患者中，67例(48.55%)癌組織中UHRF2高表達(dá)。結(jié)果(圖1)顯示：UHRF2主要表達(dá)于ICC細(xì)胞質(zhì)中，且UHRF2在癌組織中的表達(dá)高于對(duì)應(yīng)癌旁組織。

圖1 UHRF2在ICC及癌旁組織中表達(dá)

2.2 UHRF2表達(dá)與ICC患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果(表1)表明：UHRF2表達(dá)在不同甲胎蛋白(AFP)水平(P=0.010)、腫瘤分化程度(P=0.026)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(P=0.001)、TNM分期(P=0.019)ICC患者中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 UHRF2與患者臨床特征的關(guān)系 n

HBsAg：乙肝表面抗原；CA19-9：糖類抗原19-9；AFP：甲胎蛋白

2.3 UHRF2與ICC患者預(yù)后的關(guān)系 結(jié)果(圖2)表明：138例患者5年生存率為22.46%(31/138)，UHRF2高表達(dá)組(13.43%，9/67)低于低表達(dá)組(30.99%，22/71；P<0.001)；138例患者5年累計(jì)復(fù)發(fā)率為76.81%(106/138)，UHRF2高表達(dá)組(83.58%，56/67)高于UHRF2低表達(dá)組(70.42%，50/71；P<0.001)。

2.4 ICC患者預(yù)后因素分析 單因素分析(表2)顯示：腫瘤大小、腫瘤個(gè)數(shù)、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無(wú)癌栓、TNM分期、UHRF2表達(dá)影響ICC患者的5年生存率和5年累計(jì)復(fù)發(fā)率(P<0.05)。多因素分析(表3)顯示：腫瘤大小、UHRF2表達(dá)是ICC患者5年生存率和累計(jì)復(fù)發(fā)率的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。

圖2 UHRF2高低表達(dá)組ICC患者5年生存率與累計(jì)復(fù)發(fā)率的比較P<0.001

影響因素5年生存率HR(95%CI)P值5年累計(jì)復(fù)發(fā)率HR(95%CI)P值性別(男vs女)1.015(0.690～1.493)0.9390.962(0.654～1.414)0.962年齡(<53歲vs≥53歲)0.878(0.600～1.287)0.5060.826(0.563～1.210)0.326HBsAg(陰性vs陽(yáng)性)0.952(0.645～1.405)0.8060.848(0.571～1.260)0.414CA19-9(<37vs≥37,ng/mL)0.848(0.570～1.261)0.4150.817(0.549～1.216)0.319AFP(<20vs≥20,ng/mL)0.703(0.399～1.238)0.2230.903(0.504～1.617)0.731周圍侵犯(有vs無(wú))0.750(0.440～1.276)0.2890.677(0.397～1.154)0.151腫瘤大小(<5cmvs≥5cm)0.565(0.340～0.939)0.0280.491(0.291～0.826)0.007腫瘤個(gè)數(shù)(單個(gè)vs多個(gè))0.415(0.220～0.781)0.0060.348(0.183～0.662)0.001腫瘤分化(高vs低)0.659(0.449～0.967)0.0330.647(0.440～0.950)0.026淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有vs無(wú))0.547(0.358～0.837)0.0050.496(0.326～0.755)0.001癌栓(有vs無(wú))0.582(0.361～0.941)0.0270.578(0.357～0.934)0.025肝硬化(有vs無(wú))0.842(0.572～1.239)0.3820.896(0.608～1.319)0.578TNM分期(Ⅰ～ⅡvsⅢ～Ⅳ)1.754(1.185～2.595)0.0051.920(1.300～2.836)0.001UHRF2表達(dá)(高vs低)2.207(1.494～3.261)0.000a1.976(1.340～2.914)0.001

HBsAg：乙肝表面抗原；CA19-9：糖類抗原19-9；AFP：甲胎蛋白

表3 ICC患者多因素Cox分析

3 討 論

作為UHRF家族蛋白成員，既往對(duì)于UHRF2的研究主要集中于表觀遺傳學(xué)方面，如DNA甲基化等[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤中，其可與周期相關(guān)蛋白[22]、p53[23]相互作用。UHRF2在腫瘤中的作用較為復(fù)雜，臨床意義目前也不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，UHRF2在部分ICC患者中高表達(dá)，高表達(dá)者生存率低于低表達(dá)者、復(fù)發(fā)率高于低表達(dá)者，且UHRF2是ICC患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，提示UHRF2可用于預(yù)測(cè)ICC患者的生存和腫瘤復(fù)發(fā)。此外，本研究中，UHRF2與AFP水平、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，提示UHRF2可能參與腫瘤的分化和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，UHRF2表達(dá)與ICC腫瘤的惡性程度相關(guān)，高表達(dá)者預(yù)后較低表達(dá)者更差，可作為ICC預(yù)后指標(biāo)用于臨床。今后將加大樣本量進(jìn)一步分析其與ICC患者臨床指標(biāo)的關(guān)系，并探討其作用機(jī)制。

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