薛清，李寧，褚恒，劉曉紅，韓林，徐志云

主動(dòng)脈瓣鈣化性狹窄是最常見(jiàn)的心臟瓣膜疾病之一，也是導(dǎo)致老年主動(dòng)脈瓣病變的主要原因［1］。近年來(lái)，隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程加劇，主動(dòng)脈瓣病變發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)，目前其唯一有效的治療方法是手術(shù)［2］，而如何從發(fā)病機(jī)制著手進(jìn)行干預(yù)、控制病情進(jìn)展甚至逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程是當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。近年來(lái)，有關(guān)主動(dòng)脈瓣鈣化的基礎(chǔ)研究越來(lái)越多。第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院心血管外科是全軍心臟外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，在主動(dòng)脈瓣鈣化相關(guān)領(lǐng)域研究較為深入。既往有基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示，細(xì)胞外酸堿環(huán)境對(duì)血管平滑肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞等細(xì)胞鈣化具有明顯影響［3-4］。鑒于此，本研究擬通過(guò)改變主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基的酸堿度來(lái)觀察瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化情況，以明確細(xì)胞外酸堿環(huán)境對(duì)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主動(dòng)脈瓣膜 主動(dòng)脈瓣膜來(lái)源于2017年1—6月在第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院心血管外科接受心移植手術(shù)的患者，患者均知情并簽署知情同意書。取外觀正常的主動(dòng)脈瓣膜備用。

1.1.2 主要試劑 人Ⅱ型膠原酶（Sigma-Aldrich公司），胎牛血清（Gibco公司），DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），青霉素/鏈霉素雙抗液（Gibco公司），0.25%胰蛋白酶（Gibco公司），鼠抗人波形蛋白（Vimentin）抗體（Santa Cruz公司），Alexa Fluor594標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）（Santa Cruz公司），鼠抗人CD31抗體（Santa Cruz公司），Alexa Flour568標(biāo)記的羊抗鼠IgG（Santa Cruz公司），β-甘油磷酸（Sigma-Aldrich公司），抗壞血酸（Sigma-Aldrich公司），地塞米松（Sigma-Aldrich公司），1 mol/L鹽酸溶液（自制），7.4%碳酸氫鈉溶液（自制），茜素紅（上海生工生物工程股份有限公司），Trizol試劑（Beyotime公司），三氯甲烷（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），異丙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），DEPC處理水（Solarbio公司），PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa 公司），SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa公司），SDS蛋白裂解液（Beyotime公司），PMSF（Beyotime公 司），BCA試 劑 盒（Beyotime公司），彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（Beyotime公司），SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液5x（Beyotime公司），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（Beyotime公司），三羥甲基氨基甲烷（廣東金砂化工廠有限公司），十二烷基硫酸鈉（廣東金砂化工廠有限公司），甘氨酸（廣東金砂化工廠），多聚甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），Western封閉液（Beyotime公司），Western一抗稀釋液（Beyotime公司），兔抗人Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）抗體（Bioworld公司），鼠抗人β-ACTIN抗體（Santa Cruz公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（Bioworld公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（Bioworld公司），超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Beyotime公司）。

1.1.3 主要儀器 酸度計(jì)（北京時(shí)代新維測(cè)控設(shè)備有限公司），液氮罐（Locator公司），IX70激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus公司），流式細(xì)胞儀（ThermoFisher公司），低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司），NanoDrop2000分光光度計(jì)（ThermoFisher公司），GeneAmp聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀（Applied Biosystems公司），ABI Step One熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司），酶標(biāo)儀（Princeton公司），蛋白電泳儀（Bio-Rad公司），電泳槽（Bio-Rad公司），PVDF膜（Millipore公司），SX-100凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞分離和培養(yǎng) 采用二次膠原酶消化法分離主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，具體如下：取正常主動(dòng)脈瓣膜組織經(jīng)人Ⅱ型膠原酶消化處理兩次后去除組織殘?jiān)?，剩余液體1 500 r/min離心5 min（離心半徑r=168 mm），去上清，底部沉淀即為主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞。將細(xì)胞重懸后接種于培養(yǎng)板，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液1次，至細(xì)胞融合度達(dá)到90%～100%傳代，取第3～5代細(xì)胞備用。

1.2.2 主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鑒定 （1）采用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)Vimentin，具體如下：4%多聚甲醛固定第3代細(xì)胞，0.2% TritonX-100破膜，5%胎牛血清封閉，加鼠抗人Vimentin抗體和Alexa Fluor594標(biāo)記的羊抗鼠IgG，DAPI復(fù)染，顯微鏡下拍照，其中紅色熒光為Vimentin、藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。（2）采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞，具體如下：采用0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min離心5 min（離心半徑r=168 mm），去上清重懸；加鼠抗人CD31抗體，1 500 r/min離心5 min（離心半徑r=168 mm），去上清重懸；加Alexa Fluor568標(biāo)記的羊抗鼠IgG，1 500 r/min離心5 min（離心半徑r=168 mm），去上清重懸，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 分組 將傳代的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為A、B、C、D 4組，A組使用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，pH值為7.4；B組使用普通培養(yǎng)基+鈣化培養(yǎng)基培養(yǎng)，pH值為7.1；C組使用普通培養(yǎng)基+鈣化培養(yǎng)基培養(yǎng)，pH值為7.4；D組使用普通培養(yǎng)基+鈣化培養(yǎng)基培養(yǎng)，pH值為7.7。普通培養(yǎng)基：10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素雙抗液；鈣化培養(yǎng)基：β-甘油磷酸10 mmol/L、抗壞血酸10 μg/ml、地塞米松10 nmol/L。使用自制鹽酸溶液和碳酸氫鈉溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH值。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）、Runx2、堿性磷酸酶（ALP） mRNA表達(dá)情況，具體如下：將4組細(xì)胞培養(yǎng)7 d，采用Trizol試劑抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，將 cDNA 2 μl、DEPC 處理水 7 μl、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μl、正向引物 0.5 μl、反向引物0.5 μl配制成20 μl反應(yīng)體系并行定量PCR，PCR反應(yīng)步驟：pre-incubation：95 ℃（30 s），1個(gè)循環(huán)；amplification：95 ℃（10 s），60 ℃（20 s），40個(gè)循環(huán)；Melting Curve：95 ℃（15 s），60 ℃（60 s），95 ℃（60 s），1個(gè)循環(huán)；Cooling：40 ℃（60 s）1個(gè)循環(huán)。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果采用ΔΔCt法分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of real-time fluorescence quantitative PCR

1.2.5 Western Blot法 采用Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞BMP-2、Runx2蛋白表達(dá)情況，具體如下：將4組細(xì)胞培養(yǎng)7 d，采用SDS蛋白裂解液/PMSF抽提總蛋白，經(jīng)超聲破碎儀輔助裂解，于沸水中煮10～15 min制成蛋白樣本；配制SDS-PAGE分離膠、濃縮膠、電泳緩沖液，每組蛋白樣本取20 μl進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后根據(jù)目的蛋白分子量裁剪目的條帶和內(nèi)參條帶，Western封閉液封閉1 h，將目的條帶和內(nèi)參條帶分別浸沒(méi)在由Western一抗稀釋液、目的蛋白抗體或內(nèi)參蛋白抗體配制的一抗工作液中，4 ℃搖床搖晃過(guò)夜；復(fù)溫1 h，TBST緩沖液清洗3次，10 min/次，配制二抗工作液并浸沒(méi)目的條帶和內(nèi)參條帶，搖床搖晃1 h，TBST緩沖液清洗3次，10 min/次；將目的條帶和內(nèi)參條帶分別置于SX-100凝膠成像分析系統(tǒng)中，滴加超敏ECL化學(xué)發(fā)光液并拍照；采用Image J軟件處理圖像，以目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.6 比色法 采用比色法檢測(cè)細(xì)胞ALP活性，具體如下：將4組細(xì)胞培養(yǎng)21 d，去除培養(yǎng)基，加入1 ml GENMED清理液，覆蓋細(xì)胞表面，小心吸除清理液，使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞；再次加入1 ml GENMED清理液，混勻后移至預(yù)冷的1.5 ml離心管中，1 200 r/min離心5 min（離心半徑r=168 mm），去上清；加入200 μl GENMED裂解液，混勻后移至新的預(yù)冷的1.5 ml離心管中，震蕩15 s，冰上孵育30 min，13 000 r/min離心5 min（離心半徑r=47 mm）；移取500 μl上清液至新的預(yù)冷的1.5 ml離心管中，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度；96孔板依次加入220 μl GENMED緩沖液、25 μl GENMED反應(yīng)液，37 ℃孵育3 min，分別加入5 μl GENMED清理液或待測(cè)樣本，置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)405 nm波長(zhǎng)時(shí)0 min、5 min讀數(shù)，并計(jì)算ALP活性，ALP活性=〔（待測(cè)樣本讀數(shù)-對(duì)照樣本讀數(shù)） ×樣本稀釋倍數(shù)×0.25〕/〔0.005×18.5×0.6×5〕/待測(cè)樣本蛋白濃度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.7 茜素紅染色 4組細(xì)胞培養(yǎng)21 d后，采用4%多聚甲醛固定10 min，1%茜素紅染色10 min，95%乙醇沖洗后顯微鏡下觀察并拍照，其中橘紅色結(jié)節(jié)為鈣化結(jié)節(jié)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果 Vimentin是主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示，Vimentin陽(yáng)性率接近100%，見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果（DAPI復(fù)染，×200）Figure 1 Cell immunofluorescence test results

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果 CD31是內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞CD31陽(yáng)性率為1.17%，見(jiàn)圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果Figure 2 Flow cytometry results

2.3 細(xì)胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA表達(dá)情況 將A組作為對(duì)照，B、C、D組細(xì)胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C、D組細(xì)胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量高于B組，D組細(xì)胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表2）。

表2 B、C、D組細(xì)胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（x ±s）Table 2 Comparison of relative mRNA expression of BMP-2，Runx2 and ALP in B group，C group and D group

2.4 細(xì)胞BMP-2和Runx2蛋白表達(dá)情況 4組細(xì)胞BMP-2、Runx2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B、C、D組細(xì)胞BMP-2、Runx2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于A組，C、D組細(xì)胞BMP-2、Runx2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于B組，D組細(xì)胞BMP-2、Runx2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表3、圖3）。

表3 4組細(xì)胞BMP-2和Runx2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（x±s）Table 3 Comparison of relative protein expression of BMP-2 and Runx2 in the four groups

圖3 4組細(xì)胞BMP-2、Runx2蛋白電泳結(jié)果Figure 3 Protein electrophoretic results of BMP-2 and Runx2 in the four groups

2.5 細(xì)胞ALP活性 A組細(xì)胞ALP活性為（0.017±0.002）U/mg，B 組為（0.061±0.003）U/mg，C組為（0.105±0.006）U/mg，D組為（0.145±0.005）U/mg。4組細(xì)胞ALP活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=495.40，P＜0.001）；B、C、D細(xì)胞組ALP活性高于A組，C、D組細(xì)胞ALP活性高于B組，D組細(xì)胞ALP活性高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)圖4）。2.6 茜素紅染色結(jié)果 茜素紅染色結(jié)果顯示，A組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)較少，B、C、D組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)逐漸增多；與C組相比，B組鈣化結(jié)節(jié)明顯減少，D組鈣化結(jié)節(jié)明顯增多，見(jiàn)圖5。

3 討論

主動(dòng)脈瓣膜組織由內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)組成，其中大多數(shù)瓣膜組織細(xì)胞是間質(zhì)細(xì)胞，其對(duì)維持瓣膜正常功能及促進(jìn)瓣膜疾病發(fā)生發(fā)展具有重要作用。原代主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞懸浮狀態(tài)時(shí)呈圓形或橢圓形，貼壁生長(zhǎng)后呈梭形或紡錘形、多角形，表達(dá)Vimentin和少量α-平滑肌肌動(dòng)蛋白。本研究結(jié)果顯示，第3代細(xì)胞Vimentin陽(yáng)性率接近100%，且內(nèi)皮細(xì)胞含量較低，提示分離、培養(yǎng)出的細(xì)胞是主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，且純度較高，符合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)要求。

圖4 4組細(xì)胞ALP活性比較Figure 4 Comparison of activity of ALP in the four groups

圖5 4組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)情況（茜素紅染色，×100）Figure 5 Calcified nodules in the four groups

近年來(lái)，有關(guān)主動(dòng)脈瓣鈣化性狹窄的機(jī)制研究較多，主流觀點(diǎn)認(rèn)為瓣膜異位鈣化類似成骨，是一個(gè)主動(dòng)的、可逆的病理過(guò)程［5］，其中涉及瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、新生血管形成、血流機(jī)械應(yīng)力改變、脂質(zhì)浸潤(rùn)、鈣磷代謝紊亂、炎癥刺激等多個(gè)方面［6］，而BMP-2、Runx2、ALP等在瓣膜間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中扮演著重要角色。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）超家族重要成員之一，可誘導(dǎo)骨、軟骨及骨相關(guān)結(jié)締組織形成。BMP-2作為促成骨化最重要的細(xì)胞外信號(hào)分子，可通過(guò)BMP-2/Smads/Runx2/Osterix信號(hào)通路參與間質(zhì)細(xì)胞成骨化過(guò)程［7］：BMP-2經(jīng)配體與其受體結(jié)合后激活Smads復(fù)合物（Smad1、Smad5、Smad8），將信號(hào)由細(xì)胞膜外傳遞至細(xì)胞核，啟動(dòng)Runx2表達(dá)，進(jìn)而激活下游Osterix，促進(jìn)細(xì)胞成骨化［8］，而Runx2具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化、軟骨細(xì)胞成熟等作用［9］；除上述BMP-2信號(hào)通路處，Runx2還在其他多個(gè)信號(hào)通路中發(fā)揮著促成骨化作用，如Wnt/β-catenin信號(hào)通路［10］、Notch信號(hào)通路等［11］。既往基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，瓣膜間質(zhì)細(xì)胞在鈣化培養(yǎng)基作用下向成骨細(xì)胞分化時(shí)Runx2表達(dá)明顯升高［12-13］。因此，BMP-2和Runx2可評(píng)估瓣膜間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化程度［14］。本研究結(jié)果顯示，C、D組細(xì)胞BMP-2、Runx2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量高于B組，D組細(xì)胞BMP-2、Runx2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量高于C組，提示細(xì)胞外酸性環(huán)境可抑制主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化，而堿性環(huán)境則可促進(jìn)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化，分析其機(jī)制可能與細(xì)胞外酸堿環(huán)境影響B(tài)MP-2信號(hào)通路有關(guān)。

ALP是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物，正常瓣膜間質(zhì)細(xì)胞不存在ALP。既往基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在鈣化培養(yǎng)基作用下瓣膜間質(zhì)細(xì)胞逐漸成骨化，并表達(dá)ALP［15］；ALP活性與鈣離子濃度呈正相關(guān)，即細(xì)胞鈣化程度越高則ALP活性越高［16］；ALP抑制劑左旋咪唑可抑制鈣化形成［17］。因此，ALP活性與瓣膜間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化程度有關(guān)［18］。本研究結(jié)果顯示，C、D組細(xì)胞ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量及活性高于B組，D組細(xì)胞ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量及活性高于C組，亦提示細(xì)胞外酸性環(huán)境可抑制主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化，而堿性環(huán)境則可促進(jìn)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化。

既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，瓣膜間質(zhì)細(xì)胞在鈣化培養(yǎng)基作用下逐漸成骨化，出現(xiàn)鈣鹽沉積，經(jīng)茜素紅染色呈橘紅色結(jié)節(jié)［6］。本研究結(jié)果顯示，A組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)較少，B、C、D組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)逐漸增多；與C組相比，B組鈣化結(jié)節(jié)明顯減少，D組鈣化結(jié)節(jié)明顯增多，再次證實(shí)細(xì)胞外酸性環(huán)境可抑制主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化，而堿性環(huán)境則可促進(jìn)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化。

綜上所述，細(xì)胞外酸性環(huán)境可抑制主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化，堿性環(huán)境則可促進(jìn)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化，其機(jī)制可能與細(xì)胞外酸堿環(huán)境影響B(tài)MP-2信號(hào)通路有關(guān)，但具體機(jī)制尚有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

作者貢獻(xiàn)：薛清、劉曉紅、韓林、徐志云進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；薛清、李寧、褚恒、劉曉紅進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施與可行性分析，結(jié)果分析與解釋；薛清、李寧、褚恒負(fù)責(zé)撰寫論文；劉曉紅、韓林進(jìn)行論文的修訂；韓林、徐志云負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；韓林對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。

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