謝娟平，黨 鑫

(安康學院 秦巴中藥資源研發(fā)中心，陜西 安康 725000)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器試劑

犁頭草分別采集于安康市佛坪鎮(zhèn)、安康市漢濱區(qū)、渭南市、西安市等地。

紫外分光光度計UV-6100 PC(上海美普達儀器有限公司)；分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；超聲波清洗器KH2200E型(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；電熱鼓風干燥箱101-1AB型(天津市泰斯特儀器有限公司)；旋轉蒸發(fā)儀RE-52AA(上海雅榮生化儀器設備有限公司)；循環(huán)水式真空泵SHR-Ⅲ(西安泰康生物科技有限公司)。

蘆丁對照品(純度99.9%，上海友思生物技術有限公司)；薄層層析硅膠(硅膠G，青島海浪硅膠干燥劑廠)；羧甲基纖維素鈉(AR，天津市科密歐化學試劑有限公司)；無水乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯、結晶氯化鋁等試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線

對照品溶液的制備。精確稱量蘆丁標準品20 mg，移至100 mL容量瓶中，70%乙醇定容，搖勻即得，備用[8]。

吸收波長的確定。取上述溶液70%乙醇稀釋5倍，于UV-6100 PC紫外可見分光光光度計上在200～800 nm波長范圍內掃描，得最大吸收波長為273 nm。

標準曲線的制備。取蘆丁標液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別于25 mL容量瓶中，加入5 mL 0.1 mol·L-1的AlCl3乙醇溶液，加入70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置10 min，得一定濃度梯度的標準系列溶液。在273 nm波長處測定吸光度值[9-10]。分別以標準品的濃度及其相應的吸光度為橫縱坐標制作標準曲線，得相應的回歸線方程：A=0.034 5×C+0.005 5，R2=0.999 4，線性范圍為0.8～24.0 μg·mL-1。

1.2.2 樣品液制備

另外，公路養(yǎng)護單位還要加強對各項施工材料的控制力度，防止質量不達標的施工材料混入施工現(xiàn)場中。①瀝青材料，該項材料為公路養(yǎng)護的核心材料，在采購瀝青材料時，試驗檢驗部門需要定期抽查，一旦發(fā)現(xiàn)質量不達標的瀝青材料，禁止其進入到施工現(xiàn)場中，針對標號與產地各不相同的瀝青材料，需要將其進行分類存儲。②砂石與礦粉施工材料，檢修人員可以結合《公路工程試驗規(guī)程》條例，對砂石與礦粉等施工材料進行綜合檢測，對于檢測合格的施工材料，還要妥善存放，加強各項施工材料的防潮與防腐蝕等[3]。

取不同產地及不同生長期犁頭草，干燥，粉碎。分別精確稱量2 g，置于不同燒杯中，加入75%乙醇溶液20 mL，超聲提取30 min，稱重，75%乙醇補足重量，過濾，取濾液2 mL于10 mL容量瓶中，加75%乙醇溶液定容至刻度線。

1.3 精密度試驗

精確吸取1.2.2節(jié)下制備的安康市鎮(zhèn)坪縣犁頭草樣品溶液5份，每份0.5 mL，于25 mL容量瓶中加3 mL的0.1 mol·L-1AlCl3乙醇溶液，加70%乙醇定容，作為精密度試驗樣品溶液。取上述溶液于273 nm測定吸光度值，計算黃酮含量。

1.4 穩(wěn)定性試驗

精確吸取1.2.2節(jié)下制備的安康市鎮(zhèn)坪縣犁頭草樣品溶液5份，每份0.5 mL，于25 mL容量瓶中同1.3節(jié)下操作，制備穩(wěn)定性試驗樣品溶液。分別于0，10，20，30，40 min時在273 nm處測定吸光度值，計算黃酮含量。

1.5 樣品檢測

取1.2.2節(jié)下制備的安康市鎮(zhèn)坪縣、安康市漢濱區(qū)、渭南市、西安市、四川省廣元市犁頭草樣品溶液，每份0.5 mL，于25 mL容量瓶中同1.3節(jié)下操作，制備樣品溶液，分別測定吸光度。代入A=0.034 5C+0.005 5中計算黃酮含量，比較不同產地及不同生長期犁頭草總黃酮含量。

1.6 分離純化

取安康市鎮(zhèn)坪縣犁頭草，60 ℃干燥，粉碎，稱取1 000 g，加75%乙醇適量使粉末濕潤膨脹24 h，裝入滲漉桶中，加5倍量75%乙醇滲漉，收集滲漉液約40 L[11-13]。以上滲漉液平分為2份，1份減壓回收干燥并稱量備用，1份用來做系統(tǒng)分離。在最大吸收波長處測定吸光度值，計算犁頭草滲漉液中的總黃酮量。

用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對犁頭草滲漉液依次萃取，得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液及水溶液部分，減壓干燥，得各萃提產物，按1.2.2節(jié)下方法制備供試液并按1.3節(jié)下操作測定吸光度，計算各萃取部分的總黃酮含量[12]。

2 結果與分析

2.1 精密度和穩(wěn)定性

由表1可知，按1.3節(jié)操作測定的黃酮含量為50.471 mg·g-1，相對標準差(RSD)為1.438%，表明方法的精密度良好。按1.4節(jié)下操作測定不同時間下樣品黃酮含量平均值為50.485 mg·g-1，RSD為0.863%，表明穩(wěn)定性良好。

表1 方法學的試驗結果

2.2 黃酮含量

由表2可知，安康市鎮(zhèn)坪縣的犁頭草中總黃酮含量高達50.98%(故以此作為分離純化的原料)，且從3—5月生長期內，犁頭草中總黃酮含量呈增加趨勢。

表2 不同產地及生長期犁頭草中的黃酮含量

2.3 分離純化

2.3.1 提取

取1.6節(jié)下滲漉液20 L(相當于原藥材500 g)，按1.5節(jié)下方法在273 nm處測定吸光度值，代入回歸方程計算滲漉液黃酮濃度為0.918 1 mg·mL-1，相當于原藥材黃酮含量為36.724 mg·g-1(提取液含量為50.98 mg·g-1)，可知75%乙醇滲濾法提取犁頭草中的黃酮類物質的保留率為72.89%。滲漉液干燥共得粗提取物112.6 g，計算粗提物黃酮含量為16.31%。

2.3.2 系統(tǒng)分離

按1.6節(jié)下操作，進行分離純化，分別測定乙酸乙酯萃取部分、正丁醇萃取部分及水溶液部分黃酮含量得到各萃取物部分黃酮總量。各萃取液濃縮干燥，得萃取物總量，如表3所示。

表3 各分離純化萃提物的黃酮含量

表3表明，乙酸乙酯萃取物中黃酮類物質的含量高達73.42%，說明犁頭草中的黃酮類成分主要富集在乙酸乙酯中，可選擇乙酸乙酯部分作為進一步分離純化及開發(fā)的主要原料。

3 小結

本文以蘆丁為對照品，0.1 mol·L-1的AlCl3乙醇溶液為顯色劑，運用紫外分光光度法在273 nm處測定了犁頭草中的總黃酮含量。精密度試驗結果RSD為1.438%，說明該方法的精密性良好。顯色穩(wěn)定性試驗結果RSD為0.863%，根據不同時間間隔測得的吸光度可知，在該試驗條件下顯色產生的亮黃色絡合物比較穩(wěn)定，可用來做定量分析。用上述方法對不同時間不同地點采摘的犁頭草進行檢測發(fā)現(xiàn)，安康市鎮(zhèn)坪縣的犁頭草總黃酮含量高達50.98%，3—5月犁頭草中的黃酮類物質隨著生長不斷積累增加。

研究采用75%乙醇為溶劑，滲漉法提取犁頭草中有效成分，粗提取物總黃酮含量高達16.31%，有效成分保留率為72.89%，產品純度高，是理想的犁頭草黃酮粗提取工藝。采用系統(tǒng)分離法分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對犁頭草提取物進行萃取，檢測可知正丁醇萃取物中黃酮類物質的含量為27.56%，乙酸乙酯萃取物中黃酮類物質的含量高達73.42%。萃取分離得到的犁頭草黃酮純度高，黃酮類化合物主要集中在乙酸乙酯部分，這為進一步研究犁頭草有效成分和相關保健產品的開發(fā)提供了基礎依據。

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