邵天蔚，張曉云，丁萬(wàn)隆，王蓉，李勇*

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.中國(guó)科學(xué)院植物研究所，北京 100093）

人參Panax ginseng C.A.Mey.是五加科多年生宿根植物，我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材。人參病害嚴(yán)重影響人參的產(chǎn)量和品質(zhì)［1］，化學(xué)農(nóng)藥長(zhǎng)期不規(guī)范使用不僅造成自然生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重破壞，同時(shí)也導(dǎo)致人參農(nóng)藥殘留超標(biāo)，給人參用藥安全帶來(lái)重大安全隱患［2］。生物防治是解決藥用中藥材病害防治及農(nóng)殘問(wèn)題的有效途徑之一，芽孢桿菌屬是目前研究較為成熟且應(yīng)用較為廣泛的重要生防微生物［3-4］。根據(jù)已有研究報(bào)道，芽孢桿菌主要通過(guò)拮抗作用、競(jìng)爭(zhēng)作用、溶菌作用、誘導(dǎo)抗性和植物促生長(zhǎng)等［5］作用形式表現(xiàn)其生防作用。其中，芽孢桿菌合成具有抑菌活性的次生代謝物質(zhì)，是抑制植物致病菌生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵［6］。前期，課題組從商品化微生物菌劑中分離了三株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌，通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)證實(shí)了菌株對(duì)人參致病菌的抑菌效果，為上述菌劑在人參病害防治中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察，研究了對(duì)峙培養(yǎng)過(guò)程中三株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌對(duì)人參銹腐菌Cylindrocarpon destructans、人參黑斑菌Alternaria panax、人參根腐菌Fusarium solan i和人參灰霉菌Botrytis cinerea菌絲生長(zhǎng)的影響，并從菌株胞外分泌物中分離提取了粗脂肽、粗蛋白及有機(jī)溶劑萃取物，結(jié)合抑菌活性檢測(cè)，初步明確了三株芽孢桿菌的抑菌活性成分的有效部位。

1 材料

1.1 供試菌株

人參銹腐菌 C.destructans、人參黑斑菌A.panax、人參根腐菌 F.solani和人參灰霉菌B.cinerea以及甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌 QM、BM2和HZ3均由本課題組保存。

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 L，pH 7。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母粉5 g，瓊脂10～15 g，蒸餾水1 L，pH 7。

1.3 主要儀器及試劑

電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH6000，天津市泰斯特儀器有限公司）

恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-100H，上海智城分析儀器制造有限公司）

超凈工作臺(tái)（YT-CJ-1D，北京亞泰克科隆儀器技術(shù)有限公司）

立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋（LX-B35L型，合肥華泰醫(yī)療有限公司）

光學(xué)顯微鏡（Leica M205C，德國(guó)）

飛納臺(tái)式掃描電鏡（Phenom ProX，原產(chǎn)荷蘭）離心機(jī)（SIGMA，3K15，德國(guó)）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）循環(huán)水真空泵（SHZ-mD，上海亞榮生化儀器廠）冷凍干燥機(jī)（2-4LD plus，德國(guó)Christ凍干機(jī)有限公司）

冷凍干燥機(jī)（LGJ-18，北京松源華興科技發(fā)展有限公司）

牛津杯（內(nèi)徑8 mm，外徑9 mm）

血球計(jì)數(shù)板（0.05 mm×0.05 mm，上海市求精生化試劑儀器有限公司）

PBS緩沖溶液：KH2PO40.27 g，Na2HPO41.42 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，蒸餾水1 L，高溫滅菌后4℃保存

2 方法

2.1 對(duì)峙培養(yǎng)

將供試人參銹腐菌、人參黑斑菌、人參根腐菌和人參灰霉菌制成Φ6 mm菌餅，置于PDA平板中央，分別將拮抗菌株接種于距培養(yǎng)皿邊緣10mm處，25℃恒溫黑暗培養(yǎng)5～7 d。以只接種人參致病菌的平板作為空白對(duì)照。每個(gè)處理3次重復(fù)。

2.2 菌絲形態(tài)觀察

對(duì)峙培養(yǎng)5～7 d后，PDA平板上出現(xiàn)明顯的抑菌帶。用接種針挑取靠近拮抗菌株抑菌帶邊緣的致病菌菌絲于載玻片上，放置于樣品臺(tái)的導(dǎo)電膠上，靜置片刻后置于臺(tái)式掃描電鏡觀察盒內(nèi)，觀察病菌菌絲的顯微形態(tài)。

2.3 發(fā)酵上清液的制備

挑取1環(huán)事先活化的芽孢桿菌菌株至100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，35℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h作為種子液。按5%接種量將種子液接種到100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，相同條件振蕩培養(yǎng)48 h，所得發(fā)酵液于4℃、10 000 r·min-1離心20 min，上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，得發(fā)酵上清液。

2.4 粗脂肽提取物的制備

取10 mL發(fā)酵上清液，用6 mol·L-1的HCl調(diào)節(jié)至pH2，4℃靜置過(guò)夜。4℃，10 000 r·min-1離心20 min。將上清液調(diào)節(jié) pH7后即為酸化上清液，4℃保存，備用；所得沉淀用甲醇溶解，抽濾兩次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，所得的干燥樣品用 PBS緩沖液（0.02 mol·L-1，pH 7.2）定容至10 mL，經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌，得脂肽粗提物。

2.5 有機(jī)溶劑萃取物

取10 mL發(fā)酵上清液3份，分別加入等量的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇，萃取兩次后合并有機(jī)相，揮干溶劑，用PBS緩沖液（0.02 mol·L-1，pH 7.2）定容至10 mL，經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌，得有機(jī)溶劑萃取物。

2.6 蛋白粗提液的制備

取10 mL發(fā)酵上清液，緩慢加入固體硫酸銨顆粒，使其飽和度分別達(dá)到40%、50%、60%、70%、80%和90%，4℃靜置過(guò)夜。4℃，10 000 r·min-1離心20 min，所得沉淀用0.02 mol·L-1的PBS緩沖溶液（pH 7.2）重懸至完全溶解，所得溶液裝入透析袋（截留分子量8～14 kD）中除鹽，直至1%的BaCl2溶液滴定透析外液無(wú)沉淀生成。將透析袋內(nèi)溶液冷凍干燥，所得的干燥樣品用PBS緩沖液（0.02 mol·L-1，pH 7.2）定容至10 mL，經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌，得粗蛋白提取液。

2.7 抑菌活性檢測(cè)

在距PDA培養(yǎng)基中心2 cm處按需擺放牛津杯，每孔加入100μL待檢測(cè)溶液。將Φ6 mm人參根腐菌菌餅接種于平板中央，靜置過(guò)夜后，取下牛津杯，將PDA平板25℃倒置培養(yǎng)3～5 d后測(cè)量菌落半徑，根據(jù)抑菌率評(píng)價(jià)不同菌株的抑菌效果。

3 結(jié)果與分析

3.1 拮抗菌株對(duì)人參致病菌菌絲形態(tài)的影響

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的人參根腐菌（圖2I）、人參銹腐菌（圖2II）、人參黑斑菌（圖2Ⅲ）和人參灰霉菌（圖2Ⅳ）生長(zhǎng)正常，菌絲表面光滑，粗細(xì)均勻。

與QM對(duì)峙的人參根腐菌（圖2A）菌絲生長(zhǎng)扭曲，且結(jié)成團(tuán)塊，菌絲粗細(xì)不均，有破損現(xiàn)象，菌絲表面有凸起，不光滑；與QM對(duì)峙的人參銹腐菌（圖2B）菌絲生長(zhǎng)扭曲畸形，菌絲中段膨大，部分菌絲末端膨大或扭曲導(dǎo)致不能正常延伸；與QM對(duì)峙的人參黑斑菌（圖2C）菌絲生長(zhǎng)畸形，扭曲導(dǎo)致不能延伸，菌絲表面有瘤狀凸起，部分菌絲膨大；與QM對(duì)峙的人參灰霉菌（圖2D）菌絲生長(zhǎng)畸形，表面有顆粒物或瘤狀凸起，菌絲斷裂和破裂嚴(yán)重，且纏繞成團(tuán)狀。

圖1 拮抗菌株對(duì)人參致病菌菌絲生長(zhǎng)形態(tài)的影響

與BM2對(duì)峙的人參根腐菌（圖2E）菌絲生長(zhǎng)扭曲，在中部出現(xiàn)斷裂，部分菌絲膨大畸形，并且有瘤狀附著物；與BM2對(duì)峙的人參銹腐菌（圖2F）菌絲生長(zhǎng)扭曲畸形，纏繞成團(tuán)塊狀，部分菌絲膨大，末端不能延伸；與BM2對(duì)峙的人參黑斑菌（圖2G）菌絲生長(zhǎng)扭曲畸形，末端膨大扭轉(zhuǎn)不能延伸，表面不規(guī)則凸起且有大量的顆粒狀物；與BM2對(duì)峙的人參灰霉菌（圖2H）菌絲生長(zhǎng)畸形發(fā)生扭曲，纏繞成團(tuán)，且斷裂嚴(yán)重，表面有少量顆粒狀凸起。

與HZ3對(duì)峙的人參根腐菌（圖2M）菌絲生長(zhǎng)扭曲成團(tuán)塊狀，團(tuán)塊內(nèi)部部分菌絲斷裂破損，部分菌絲膨大，有瘤狀凸起；與HZ3對(duì)峙的人參銹腐菌（圖2J）菌絲生長(zhǎng)扭曲畸形，菌絲末端膨大導(dǎo)致延伸受阻，表面有大量的顆粒狀凸起；與HZ3對(duì)峙的人參黑斑菌（圖2K）菌絲生長(zhǎng)粗細(xì)不均，纏繞成團(tuán)，部分菌絲膨大、空泡化，末端尤為嚴(yán)重導(dǎo)致難以延伸，表面有瘤狀或顆粒狀凸起；與HZ3對(duì)峙的人參灰霉菌（圖2L）菌絲生長(zhǎng)畸形發(fā)生扭曲、折疊和畸形，表面有顆粒狀或不規(guī)則的凸起。

圖2 發(fā)酵上清液的抑菌活性

3.2 抑菌活性檢測(cè)

對(duì)峙培養(yǎng)過(guò)程中，人參根腐菌生長(zhǎng)明顯快于其他人參致病菌，故選擇該菌作為靶標(biāo)菌用于的抑菌活性檢測(cè)。

3.2.1 發(fā)酵上清液的抑菌活性 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株QM（圖2A）、BM2（圖2B）和菌株 HZ3（圖2C）發(fā)酵液對(duì)人參根腐菌生長(zhǎng)有非常顯著的抑制作用。去除菌體后，菌株QM和BM2發(fā)酵上清液抑菌活性略有下降，說(shuō)明發(fā)酵上清液中的抑菌活性成分對(duì)菌株的抑菌作用貢獻(xiàn)較大；菌株HZ3發(fā)酵上清液抑菌作用不明顯，說(shuō)明發(fā)酵上清液中僅含少量抑菌活性成分。

3.2.2 粗脂肽的制備及其活性檢測(cè) 菌株發(fā)酵上清液酸化后產(chǎn)生明顯的絮狀沉淀，經(jīng)甲醇溶解和超低溫真空冷凍干燥后得淡黃色脂肽粗提物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株QM（圖3A）、菌株BM2（圖3B）和菌株HZ3（圖3C）脂肽粗提物對(duì)人參根腐菌有明顯的抑菌效果，其抑菌效果與發(fā)酵上清液接近。三株菌的酸化上清液幾乎無(wú)抑菌效果。

圖3 脂肽粗提物的抑菌活性

用對(duì)峙培養(yǎng)法檢測(cè)脂肽粗提物對(duì)人參根腐菌的抑菌活性。研究發(fā)現(xiàn)，相同的檢測(cè)濃度下，菌株QM、BM2和 HZ3抑菌率分別為22.39±1.91%、25.83±1.03%和31.46±2.08%（表1）。

表1 脂肽粗提物對(duì)人參根腐菌生長(zhǎng)的抑制作用

3.2.3 有機(jī)溶劑萃取物及其活性檢測(cè) 用三種不同極性有機(jī)溶劑提取菌株發(fā)酵上清液中的抑菌活性成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株QM（圖4A）、BM2（圖4B）和菌株HZ3（圖4C）發(fā)酵上清液的石油醚與乙酸乙酯提取物無(wú)明顯抑菌活性。三株菌的發(fā)酵上清液的水飽和正丁醇提取液有抑菌活性，說(shuō)明極性較大的水飽和正丁醇能夠提取有效活性物質(zhì)。

3.2.4 蛋白粗提液的制備及其活性檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，40%～90%不同飽和度硫酸銨鹽析出的粗蛋白均有一定的抑菌效果（圖5）。相同濃度的粗蛋白提取物的抑菌活性與硫酸銨飽和度存在相關(guān)性，菌株QM（圖5A，圖5B）、菌株HZ3（圖5E，圖5F）和菌株HZ3（圖5E，圖5F）的抑菌物質(zhì)對(duì)人參根腐菌的抑制率隨硫酸銨飽和度的增加而提高，飽和度為70%時(shí)抑菌率達(dá)到最大值，之后隨硫酸銨飽和度增加，蛋白提取液的活性未發(fā)生明顯變化。

圖4 不同有機(jī)溶劑萃取液的抑菌活性檢驗(yàn)

圖5 不同飽和度的硫酸銨沉淀的抑菌作用

4 討論

根據(jù)現(xiàn)有研究報(bào)道，芽孢桿菌的抑菌機(jī)制主要有寄生、競(jìng)爭(zhēng)、抗生、溶菌作用和誘導(dǎo)抗病性等［7］。甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌B.methylotrophicus是Madhaiyan等［8］于2010年從水稻根際土壤中分離獲得的，并確認(rèn)其為芽孢桿菌屬的一個(gè)新種。研究發(fā)現(xiàn)，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌可產(chǎn)生抑菌脂肽、蛋白酶、纖維素酶和嗜鐵素等抑菌活性物質(zhì)［9-10］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌蛋白對(duì)人參銹腐菌菌絲生長(zhǎng)也有強(qiáng)烈的抑制作用，可以導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中分支增多、斷裂和菌絲空洞［11］。

本研究發(fā)現(xiàn)，三株供試甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌與人參致病菌對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)均產(chǎn)生明顯的抑菌帶，顯微觀察發(fā)現(xiàn)與甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌對(duì)峙培養(yǎng)的人參致病菌表現(xiàn)為菌絲表面凹凸不平、膨大泡狀、斷裂破裂、扭曲纏繞等現(xiàn)象，推測(cè)3株芽孢桿菌產(chǎn)生了具有抗生及溶菌作用的抑菌活性物質(zhì)［12-14］。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，三株供試甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌發(fā)酵上清液蛋白粗提物、脂肽粗提物以及有機(jī)溶劑提取物均有不同程度的抑菌活性，說(shuō)明三株芽孢桿菌胞外分泌液中的抑菌活性成分并不單一，它們可能單獨(dú)發(fā)揮抑菌作用，也可能多種活性物質(zhì)協(xié)同抑菌，這為揭示生防細(xì)菌的抗菌機(jī)理提供了參考依據(jù)。抑菌活性物質(zhì)的生物學(xué)功能及其作用靶點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究。

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