孫志偉 李紅月

【摘要】目的：建立測定天麻藥材中兩種主要化學成分的HPLC含量測定方法;在此基礎上，測定宜昌栽培天麻天麻素、對羥基苯甲醇含量與栽培年限之間的變化關系。方法：采用HPLC對不同生長年限栽培天麻中天麻素、對羥基苯甲醇含量進行測定。結(jié)果：天麻中各天麻素、對羥基苯甲醇含量隨栽培年限變化較大。結(jié)論：本方法簡便、可靠，可用于天麻中天麻素、對羥基苯甲醇含量測定。

【關鍵詞】天麻;不同年限;含量測定;HPLC

天麻為蘭科植物天麻GastrodiaelataBlume的干燥塊莖，主產(chǎn)于云南、四川、陜西、貴州、湖北等地，具有平肝息風、祛風定驚、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等功效[1]，含有酚類、多糖、甾醇、有機酸等多種成分[2]，而天麻素、對羥基苯甲醇等酚類化合物通常被認為是天麻的主要活性成分。2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定，按干品計，天麻素和對羥基苯甲醇總含有量不得低于0.25%[3]，也是以天麻素及對羥基苯甲醇的含量作為天麻質(zhì)量評價指標。

宜昌是天麻栽培主產(chǎn)區(qū)之一，然天麻種植多以農(nóng)戶散種為主，種植規(guī)范性較差，采收年限存在較大差異[4]。天麻屬多年生植物，作為次生代謝產(chǎn)物的苷類等有效成分的積累可能與植物的生長年限存在相關性。然而對于天麻栽培品栽培年限對天麻有效成分積累的研究，國內(nèi)外文獻少有報道?；诖?，本研究以天麻素、對羥基苯甲醇為指標研究天麻栽培品栽培年限與天麻有效成分積累的關系。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀， 含Waters2690色譜工作站（美國Water公司）;TC-C18色譜柱色譜柱，（4.6mmx250mm，5μm）（安捷倫公司）;BT-125D型電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）;KQ-500B型超聲波振蕩清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;天麻素（中國食品藥品檢定研究院，批號110807-200205）;對羥基苯甲醇（中國食品藥品檢定研究院，批號111970～201405）。

色譜分析用乙腈（色譜純，美國Fisher公司）;水為娃哈哈純凈水;其他試劑均為分析純。

不同年限天麻栽培品均采集自宜昌市夷陵區(qū)聚寶天麻專業(yè)種植基地。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動相為乙腈-0.05%磷酸（5：95）。流速為l.OmL.min-1。波長210nm，柱溫30℃。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取天麻素對照品10.6mg及對羥基苯甲醇對照品5.8mg，加50%甲醇定容于5 0mL容量瓶中，制成濃度為含天麻素0.212mg/mL、對羥基苯甲醇0.116mg/mL的混合對照品溶液儲備液。取上述溶液lOμL進樣，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖（見圖1）。

2.3 供試品溶液制備

取天麻，粉碎，過5號篩，精密稱定細粉約lg，加60%甲醇超聲提取30min，過濾，取濾液定容于lOOmL容量瓶中，搖勻。再用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。取各供試品溶液lOμL進樣，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖（見圖2）。

2.4 工作曲線繪制

精密吸取2.2項下對照品儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、8.Oml，定容于lOml容量瓶中，上述溶液進樣lOμL，測定峰面積，以對照品濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，得線性回歸方程為：天麻素Y=235.742X+0.764，F(xiàn)0.9996， 線性范圍為0.01-0.16μg/mL，對羥基苯甲醇Y=396.745X+1.064.F0.9994，線性范圍為0.01-0.12μg/mL。

2.5 精密度試驗

吸取等體積的對照品溶液10μL，連續(xù)進樣，按“2.1”項條件下測定5次，記錄兩峰峰面積。結(jié)果天麻素的RSD值為0.64%（n=5），對羥基苯甲醇的RSD值為0.43%（n=5），均顯示儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取3年生天麻供試品，分別于0、2、4、6、8、lOh測定，結(jié)果天麻素的RSD值為3.18% （n=6），對羥基苯甲醇的RSD值為2.45%（n=6），表明樣品溶液在lOh內(nèi)較穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

取3年生天麻粉末lg，按“2.3”項下制備供試樣品溶液6份，在“2.1”項條件下色譜條件下進樣lOμL，根據(jù)線性回歸方程計算天麻素、羥基苯甲醇含量，結(jié)果天麻藥材中天麻素的含量平均為2.69mg.g^-1，RSD=0.96% （n=6）;對羥基苯甲醇的含量平均為1.16mg-g^-1，RSD=1.31% （n=6）。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱定天麻樣品0.5g，精確加入約5mg天麻素及對羥基苯甲醇對照品，混勻后，按“2.1”項下方法重復測定5次，天麻素平均回收率為102.12，RSD=3.48%，對羥基苯甲醇平均回收率為98.47，RSD=2.68%。

2.9 樣品含量的測定

取宜昌市夷陵區(qū)聚寶天麻專業(yè)種植基地采集的栽培期限為1-4年生的天麻藥材4批，干燥后，按“2.3”項下方法處理。精密吸取供試品溶液，進樣lOμL，用外標法測定含量，不同栽培年限天麻天麻素、對羥基苯甲醇含量見見表l。

3 討論

（l）在提取方式考察上，本實驗采用正交實驗法考察不同濃度的甲醇、乙醇作為溶劑及不同提取時間等因素對提取率的影響，最終確定本實驗采用的60%甲醇超聲提取30min的最佳提取方法。

（2）本實驗考察了乙腈一水、乙腈一磷酸溶液、乙腈一三氟乙酸、乙腈一乙酸銨溶液等流動相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.05%磷酸分離效果較好。

（3）在對湖北宜昌不同栽培年限天麻進行含量測定，發(fā)現(xiàn)1-4年生栽培天麻均符合藥典標準。但1-3年生天麻，隨著栽培年限的提高，天麻素與對羥基苯甲醇總量有所下降，可能是由于此生長階段，藥材生長速度較快，淀粉、纖維素等初級代謝產(chǎn)物積累較多，其積累速率大于有效成分積累速率所致;第4年天麻素與對羥基苯甲醇含量有所提升，也可能由于此時藥材增重速率變慢，有效成分積累速率相對更快所致。

參考文獻

[1]李云，王志偉，耿巖玲等，天麻素注射液的藥理機制及臨床應用研究進展[J].中國藥房，2016，27 （32）：4602-4604.

[2]吳仲珍，李育生，劉麗丹等.天麻有效成分的藥理功效及其提取工藝的研究進展[J].保鮮與加工，2014，14 （03）：5861.

[3]國家藥典委員會，中華人民共和國藥典：201 5年版一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2 015： 59.

[4]張躍進，梁鎖，周元等，不同栽培措施對天麻產(chǎn)量和產(chǎn)量結(jié)構(gòu)的影響研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2009， 37 （03）：1134-1135.