戴淑芳, 孫藝平,傅 雷,于德欽,徐 靜,穆靖洲，崔曉雯,姜永珊,劉克敏

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧 大連 116044； 2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中醫(yī)康復(fù)科，遼寧 大連 116011)

急性一氧化碳中毒(carbon monoxide poisoning，CO-P) 是生活和生產(chǎn)中常見的中毒性疾病, 嚴(yán)重者可危及生命。CO-P對(duì)機(jī)體的損害快速而廣泛，特別是體內(nèi)血管吻合支少而且代謝旺盛的器官如大腦和心臟最易遭受損害，但由于其常以頭暈、神志不清、反應(yīng)遲鈍和昏迷等為主要臨床表現(xiàn)，掩蓋了心臟及其他臟器受損的表現(xiàn)，醫(yī)務(wù)工作者常把注意力集中在神經(jīng)系統(tǒng)的損害方面，而忽略了對(duì)心肌損害的預(yù)防及治療。臨床上高壓氧(hyperbaric oxygenation，HBO)對(duì)急性 CO-P 的治療作用眾所周知，但它對(duì)急性 CO-P 導(dǎo)致的心肌損傷是否有預(yù)防作用，卻無定論。本研究觀察急性CO-P大鼠心電圖及心肌超微結(jié)構(gòu)的病理改變以及高壓氧(HBO)對(duì)其影響, 旨在進(jìn)一步探討 HBO 對(duì)急性 CO-P預(yù)防及治療的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SD 大鼠50只，體重230～270 g, 購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(遼)2013-0003。

隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)10只；40只大鼠用于模型建立，死亡12只，剩余28只造模成功的急性 CO-P 大鼠，按體重隨機(jī)分為急性一氧化碳中毒組(CO-P組)14只；急性一氧化碳中毒高壓氧治療組(HBO組)14只。

1.2 急性CO中毒模型的建立

室溫20～24 ℃下，采用分次腹腔注射法建立大鼠急性 CO中毒模型。首次注射 CO 純品氣體(高純一氧化碳99.9%)120 mL/kg后，連續(xù)3次按首次劑量的1/2即 60 mL/kg追加注射,間隔時(shí)間為4 h[1]。另取10只正常SD大鼠同法注射等量空氣作為對(duì)照組。

對(duì)照組:大鼠按照120 mL/kg接受腹腔注射空氣后,立即表現(xiàn)出煩躁興奮狀態(tài),隨后精神逐漸萎靡不振,蜷縮成團(tuán)。約10～15 mL后自然緩解、狀態(tài)逐漸恢復(fù),跟蹤觀察數(shù)天未發(fā)現(xiàn)任何后遺癥表現(xiàn)，無死亡。

模型組：分次腹腔注射純品 CO 氣體后，大鼠均在 15 min內(nèi)出現(xiàn)不同程度的腦損傷：陸續(xù)出現(xiàn)少動(dòng)、四肢癱軟、抽搐,肢端皮膚呈櫻桃紅色等表現(xiàn)。部分大鼠在發(fā)病過程中死亡，主要死亡于第1次和第2次注射CO后， 40只大鼠第1次注射CO后(約2 h左右)死亡11只，第2次注射CO后1 h死亡1只，死亡率30%。約于末次染毒6～8 h后剩余大鼠完全蘇醒,飲食和日常活動(dòng)無明顯異常。死亡動(dòng)物尸檢發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟重度充血伴散在出血點(diǎn)，腦組織充血水腫符合急性CO中毒表現(xiàn)[2]。

染毒后大鼠舒適飼養(yǎng)，高壓氧組大鼠給予高壓氧治療。

1.3 HBO 治療

將HBO組動(dòng)物于 CO 染毒后第 1 天置于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物高壓氧艙內(nèi)，同時(shí)開放充氣閥和排氣閥以純氧洗艙 10 min，用測(cè)氧儀測(cè)得艙內(nèi)氧濃度>95%后，關(guān)閉排氣閥，觀察艙內(nèi)壓力表進(jìn)行勻速加壓，時(shí)間為 15 min，目標(biāo)壓力為 0.2 MPa(2.0ATA)，達(dá)目標(biāo)壓力后，關(guān)閉充氣閥，穩(wěn)壓 60 min，穩(wěn)壓過程中注意觀察壓力表以便發(fā)現(xiàn)有無氧氣泄漏及定時(shí)用測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)艙內(nèi)氧濃度，保證在穩(wěn)壓過程中艙內(nèi)氧濃度始終保持在95%～99%，如氧濃度低于此范圍及時(shí)進(jìn)行等壓換氣。穩(wěn)壓 60 min后，緩慢打開排氣閥，邊觀察壓力表，邊進(jìn)行勻速減壓，用 15 min減壓至常壓。

HBO 治療均于每天下午進(jìn)行，1 次/d，共 15次。即染毒后第15天停止。

1.4 心電圖檢測(cè)

將清醒大鼠固定于操作臺(tái)，在四肢皮下刺入6號(hào)金屬注射器針頭，位置參照人的相應(yīng)部位。BL-420F 生物信號(hào)采集系統(tǒng)專用心電圖導(dǎo)聯(lián)線的鱷魚夾與注射器針頭連接并作屏蔽處理，大鼠狀態(tài)穩(wěn)定后描記心電圖。

于CO染毒前，第1、2、3、4次CO注射術(shù)后1 h，第 3、7、15天，測(cè)量大鼠標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。打開BL-420F生物信號(hào)采集系統(tǒng)，選中一段心電圖，點(diǎn)擊工具條上“心功能參數(shù)測(cè)量”按鈕，觀察并記錄ST 段改變情況。

1.5 心肌顯微結(jié)構(gòu)觀察

于染毒后第1天和第16天取CO-P組和HBO組大鼠左心室小塊組織，置于4%戊二醛電鏡固定液中固定12 h，鋨酸后固定，常規(guī)透射電鏡超薄切片制片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染，H7500型透射電鏡觀察其組織形態(tài)學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)改變

正常對(duì)照組心肌細(xì)胞肌絲排列整齊,結(jié)構(gòu)清晰, 肌節(jié)規(guī)則,線粒體豐富, 線粒體膜完整, 嵴密集且排列規(guī)則，基質(zhì)密度均勻(圖1)。

CO-P組第1天可見肌原纖維斷裂、排列紊亂,Z線扭曲。線粒體腫脹、基質(zhì)疏松密度下降，嵴數(shù)量減少、斷裂、甚至出現(xiàn)空泡(圖2)。CO-P組第16天心肌細(xì)胞損傷程度減輕,心肌纖維排列規(guī)整,線粒體嵴間隙稍有增大(圖3)。HBO 組第1天的心肌細(xì)胞內(nèi)肌絲排列整齊規(guī)則，線粒體結(jié)構(gòu)大致正常，膜有破裂，可見輕度腫脹改變, 嵴排列不規(guī)整，電子致密度減少(圖4) 。HBO 組第16天心肌細(xì)胞損傷基本恢復(fù)正常，表現(xiàn)為完整的肌原纖維，清晰正常的Z線，線粒體外膜完整、嵴清晰(圖5)。

圖1 NC組(×25000)Fig 1 NC group(×25000)

圖2 CO-P組第1天(×24000)Fig 2 CO-P group day 1(×24000)

圖3 CO-P組第16天(×20000)Fig 3 CO-P group day 16(×20000)

圖4 HBO組第1天(×20000)Fig 4 HBO group day 1(×20000)

圖5 HBO組第16天(×20000)Fig 5 HBO group day 16(×20000)

2.2 各組大鼠心電圖ST段改變

和正常對(duì)照組相比，CO-P組第4次CO注射后1 h、第3、7天和HBO組第3天ST段均明顯抬高(P<0.01)。和CO-P組第4次CO注射后1 h相比，CO-P組第3天ST段明顯降低(P<0.05)，CO-P組第7、15天和HBO組第3、7、15天ST段均顯著降低(P<0.01)。和正常對(duì)照組相比，CO-P組第15天和HBO組第7、15天ST段改變不明顯(P>0.05) (表1)。

表1各組大鼠CO染毒前、后及高壓氧暴露不同時(shí)間ECG ST改變

組別例數(shù)ST段抬高幅度(mv)NC組100．03±0．02CO-P組第4次CO注射后1h140．34±0．161)CO-P組第3天140．27±0．181)2)CO-P組第7天140．20±0．081)3)CO-P組第15天140．05±0．033)HBO組第3天140．21±0．111)3)HBO組第7天140．03±0．023)HBO組第15天140．04±0．013)

1)與NC組相比P<0.01; 2)與CO-P組第4次CO注射后1 h相比,P<0.05;3)與CO-P組第4次CO注射后1 h相比,P<0.01

3 討 論

3.1 腹腔注射染毒法建立模型的可行性

建立可靠的動(dòng)物模型是本實(shí)驗(yàn)的前提和基礎(chǔ),國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)的CO中毒模型多采用CO混合氣體吸入式染毒[3]。該種方法較接近于日常生活的CO中毒途徑,濃度比較穩(wěn)定,所得結(jié)果可以避免缺氧、CO2蓄積和濕度增加等因素影響, 具有很好的參照性。但其儀器、設(shè)備費(fèi)用較高, 且通氣期間需多次檢測(cè)COHb等諸多的難題,不宜于實(shí)際操作。而且實(shí)驗(yàn)所需的CO消耗量大, 很容易影響到操作者的自身安全，染毒過程中對(duì)操作要求較高,因此明顯限制了急性CO中毒模型的制備及其研究的深入。

Fecther等[2]報(bào)告用腹腔注射CO染毒的方法建立大鼠耳蝸損傷的動(dòng)物模型獲得成功。正如靜脈注射油酸制備的急性呼吸窘迫綜合征動(dòng)物模型早為大家所公認(rèn)一樣,本實(shí)驗(yàn)采用按照120 mL/kg的標(biāo)準(zhǔn)分次腹腔注射純品建立大鼠急性 CO中毒模型，可滿足CO吸入中毒模型具備的所有條件,并無明顯差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,腹腔注射CO后,大鼠出現(xiàn)了典型的CO中毒癥狀,主要表現(xiàn)為煩躁多動(dòng)、精神萎靡、抽搐昏迷等,肢端口唇粘膜也相應(yīng)呈現(xiàn)出特征性的櫻桃紅色,此為CO中毒的典型表現(xiàn)之一。死亡動(dòng)物尸檢發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟呈現(xiàn)櫻桃紅色，充血現(xiàn)象嚴(yán)重并伴有大量散在出血點(diǎn),腦組織充血水腫也都符合急性CO中毒表現(xiàn)。腹腔注射染毒雖然與臨床急性中毒的侵入途徑不同,但其中毒機(jī)制則是完全一致的。采用本方法制備CO中毒的動(dòng)物模型操作簡(jiǎn)便,安全可靠且CO染毒劑量容易控制,影響因素少,對(duì)設(shè)備儀器也無特殊要求,可行性強(qiáng),是一種理想的制備急性CO中毒動(dòng)物模型的方法[4]。

3.2 各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)改變

本研究中急性CO-P大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)病理改變與文獻(xiàn)報(bào)道類似[5], CO-P組大鼠第1天的病理改變最嚴(yán)重,可見心肌纖維斷裂,線粒體腫脹、基質(zhì)密度變淡, 線粒體嵴斷裂、減少、模糊不清甚至溶解消失；到第16天心肌細(xì)胞損傷程度減輕。HBO組超微結(jié)構(gòu)在第1天即明顯輕于同期的CO-P組, 到第16天時(shí)已基本恢復(fù)正常。提示急性CO中毒性心肌損害經(jīng)HBO治療可以很快逆轉(zhuǎn)。發(fā)生CO 中毒時(shí)，可產(chǎn)生大量的 COHb不能攜帶氧，且不易解離；還能使血紅蛋白氧離曲線左移，妨礙氧的彌散和利用，導(dǎo)致組織缺氧、功能受損[6]。心肌細(xì)胞內(nèi)ATP在嚴(yán)重缺氧狀態(tài)下迅速耗竭，Na+-K+-ATP 酶活性降低，誘發(fā)心肌間質(zhì)充血水腫，心肌纖維斷裂，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。同時(shí)，缺氧時(shí)酸性代謝產(chǎn)物蓄積，使毛細(xì)血管通透性增加，引發(fā)細(xì)胞間質(zhì)水腫，并使循環(huán)障礙，從而加重心肌缺血缺氧[7]。此外，CO 與肌球蛋白結(jié)合，抑制細(xì)胞色素氧化酶活性，影響了心肌細(xì)胞內(nèi)氧的彌散，從而損害線粒體功能，所以細(xì)胞缺氧時(shí)線粒體會(huì)首先發(fā)生變化[8]。

3.3 各組大鼠心電圖ST段改變

心電圖檢查是臨床檢查中發(fā)現(xiàn)心臟損害最常用的手段之一。有文獻(xiàn)報(bào)道急性 CO 中毒患者 EEG 異常率高達(dá)93%[9]。心電圖出現(xiàn)缺血改變判斷標(biāo)準(zhǔn)多采用Ⅰ或Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高[10]。ST段代表心肌早期復(fù)極的電位變化，由于心肌細(xì)胞缺氧，引起酸中毒、水腫而使細(xì)胞復(fù)極發(fā)生改變，心電圖表現(xiàn)為 ST-T 改變，常見于心肌缺血和心肌勞損[11]。本實(shí)驗(yàn)中，和正常對(duì)照組相比，CO-P組第4次CO注射1 h后心電圖ST段均明顯抬高(P<0.01)。表明一氧化碳中毒對(duì)心肌有損害。其發(fā)生機(jī)理可能因血液中的碳氧血紅蛋白增多、心肌攝氧量減少、冠狀動(dòng)脈痙攣導(dǎo)致心肌缺血。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CO-P組第3、7、15天和HBO組第3、7、15天ST段均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，CO-P組第15天和HBO組第7、15天ST段改變基本恢復(fù)。可見無論CO-P組還是HBO組心電圖ST段改變都是可逆的，高壓氧治療CO-P引起心肌缺血損傷，可減少ST段下降持續(xù)時(shí)間及ST段下降幅度，加快心肌損傷的恢復(fù)，具有較好療效。這與寇鋒軍等的研究一致，CO-P對(duì)機(jī)體的影響與中毒后恢復(fù)時(shí)間有關(guān)，停止吸入CO后，第1個(gè)小時(shí)排出量最多，但碳氧血紅蛋白完全解離需要24 h以上，因此，CO-P對(duì)心肌的影響或損害程度與此有關(guān)，心電圖表現(xiàn)也不同[12-13]。

高壓氧能加速碳氧血紅蛋白的解離, 促進(jìn)CO清除, 使血紅蛋白恢復(fù)攜氧功能。高壓氧能提高血氧分壓, 增加血氧含量, 使組織得到足夠溶解氧, 大大減少機(jī)體對(duì)血紅蛋白攜氧的依賴性, 從而迅速糾正低氧血癥,改善機(jī)體缺氧狀態(tài)[14]。 綜上所述，對(duì)于急性CO-P 患者必須全面觀察病情，特別是無明顯心臟癥狀的患者或因昏迷而不能提供心臟不適癥狀的患者，需常規(guī)做心電監(jiān)護(hù)，減少漏診。應(yīng)立即脫離 CO 中毒環(huán)境，早期應(yīng)用高壓氧，及時(shí)給予心肌保護(hù)治療，預(yù)防急性CO-P導(dǎo)致的心肌損害，改善預(yù)后[15]。本研究通過亞細(xì)胞水平和心電圖分析進(jìn)一步證實(shí)HBO 治療可顯著減輕CO-P性心肌損害及加速心肌損傷的恢復(fù), 為HBO治療急性CO-P提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 周磊,劉青樂,鄭成剛,等. 急性一氧化碳中毒大鼠海馬組織NaPi-IIb蛋白表達(dá)的研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016,16(2):218-220.

[2] Fecther LD, Liu Y. MK-801 protects against carbon monoxide-induced hearing loss[J].Toxicol Appl Pharmacol, 1995,132 (2):196-202.

[3] Piantadosi CA, Zhang J, Leven ED, et al. Apoptosis and delayed neuronal damage after carbon monoxide poisoning in the rat[J]. Exp Neurol，1997,147(1):103-114.

[4] Penney DG. Acute carbon monoxide poisoning: animal models: a review[J].Toxicology,1990,62(2):123-160.

[5] 李俊坤，趙向輝，劉育慧，等．血清c TNI、MYO、CK-MB、NT-pro BNP 水平與一氧化碳中毒患者心肌損傷的相關(guān)性分析[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，25(2)：157-159,212.

[6] Geraldo AF，Silva C，Neutel D，et al． Delayed leukoencephalopathy after acute carbon monoxide intoxication[J]． J Radiol Case Rep，2014，8(5):1-8．

[7] 趙洪晶．急性一氧化碳中毒患者心肌損傷狀況分析[J]．臨床合理用藥，2014，7(2): 121-122．

[8] Frank A，Bonney M，Bonney S，et al. Myocardial ischemia reperfusion injury：from basic science to clinical bedside [J]. Semin Cardiothorac Vasc Anesth，2012，16(3)： 123-132.

[9] 王華萍，朱先存，張愛玲，等．急性一氧化碳中毒治療前后心電圖分析[J]．淮海醫(yī)藥，2012，30(1) : 63．

[10] Li Q，Song JJ，Zhang HY，et al． Dexamethasone therapy for preventing delayed encephalopathy after carbon monoxide poisoning[J]．Biotech Histochem，2015，8(2): 1-7．

[11] 漆嬋．急性一氧化碳中毒對(duì)心肌損害的臨床分析[J]．江西醫(yī)藥，2017，52(2): 138-139．

[12] 寇鋒軍，王月文．108 例急性一氧化碳中毒患者并發(fā)心肌損害分析[J]．江蘇實(shí)用心電學(xué)雜志，2013，22(2): 587-590．

[13] 蘇娟妮. 急性一氧化碳中毒轉(zhuǎn)歸心電圖演變觀察[J]. 醫(yī)技與臨床基層醫(yī)學(xué)論壇， 2011，15(4)：326-327.

[14] 劉亞宏, 劉延梅, 張雪梅,等. 急性一氧化碳中毒高壓氧治療前后的心電圖分析[J].實(shí)用醫(yī)技雜志，2006，13(13)：2267-2268.

[15] 陳靜芳, 趙學(xué)輝, 李濟(jì)宏. 急性一氧化碳中毒對(duì)心肌損害的分析[J]. 臨床心電學(xué)雜志, 2011, 20(3):209-211.