高雁艷，紀(jì) 軍，吳園園，潘艷艷，張 利

(大連市中心醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116033)

卵巢癌發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌，列居女性生殖器惡性腫瘤第三位。但因卵巢癌致死者，卻占各類婦科腫瘤的首位，對(duì)婦女生命造成嚴(yán)重威脅。卵巢癌的病因尚不清楚，其發(fā)病可能與年齡、生育、血型、精神因素及環(huán)境等有關(guān)。線粒體絲蘇氨酸蛋白激酶PINK1(PTEN induced putative kinase 1)被發(fā)現(xiàn)是帕金森氏病的一個(gè)相關(guān)基因[1]，研究表明PINK1的功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)神經(jīng)組織中線粒體保護(hù)蛋白的作用，其與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、泛素-蛋白酶體系統(tǒng)以及線粒體相關(guān)性自噬等功能緊密相關(guān)，而上述生物學(xué)功能的異常均可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[2-4]。本文通過(guò)調(diào)控PINK1在卵巢癌細(xì)胞SKOV3中的表達(dá)，觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力的變化，及其對(duì)卵巢癌化療耐藥性的影響。

1 材料和方法

1.1 材 料

人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3購(gòu)自上海細(xì)胞所。感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α購(gòu)自Takara寶生物公司。胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(YeastExtract)、瓊脂粉(Agar)和氨芐青霉素(Ampicillin)購(gòu)自Sigma公司。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)于Sigma公司。RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)定量(SYBR)PCR試劑盒均購(gòu)置自Takara寶生物公司。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)于Invitrogen公司。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3用含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素與50 g/L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫、5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 pcDNA3.1-PINK1質(zhì)粒的擴(kuò)增及鑒定

pcDNA3.1-PINK1和pcDNA3.1質(zhì)粒載體由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)劉寶琴教授饋贈(zèng)。熱休克法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，菌液鋪于氨芐陽(yáng)性LB培養(yǎng)板篩選陽(yáng)性克隆。將挑好的陽(yáng)性菌落置于大腸桿菌培養(yǎng)液中，于37 ℃培養(yǎng)箱中以250 r/min搖動(dòng)8～12 h培養(yǎng)。收集含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌，利用質(zhì)粒提取試劑盒裂解細(xì)胞，提取目標(biāo)質(zhì)粒，并將質(zhì)粒送Takara寶生物進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.3 PINK1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立

按照LipofectamineTM2000(Invitrogen)試劑說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染在6孔板進(jìn)行，2.5 μg質(zhì)粒DNA/孔。細(xì)胞分3組：正常培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1組，和過(guò)表達(dá)PINK1組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后加入800 μg/mL G418進(jìn)行篩選，每2天更換1次篩選培養(yǎng)基。篩選20 d后，大量細(xì)胞已經(jīng)死亡，可見(jiàn)有抗性的陽(yáng)性克隆開(kāi)始生長(zhǎng)，降低G418濃度至500 μg/mL，待克隆逐漸增大后，系列稀釋法按1個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種96孔板，Real-time PCR檢測(cè)PINK1的表達(dá)挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)染克隆，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Realtime PCR檢測(cè)基因表達(dá)

收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，NanoDrop微量紫外分光光度儀測(cè)定各組總RNA濃度和純度(OD260/280、OD260/230)。每組以500 ng總RNA為模板，PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。SYBR Premix Ex TaqTMⅡRealtime試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。各基因引物序列見(jiàn)表1，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果計(jì)算采用Q-Gene軟件標(biāo)準(zhǔn)曲線法[5](BioTechniques Software Library atwww.BioTechniques.com)進(jìn)行定量分析，組間基因表達(dá)量的比較以內(nèi)參基因統(tǒng)一起始模板量。

表1 各基因引物序列

1.2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期正常培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞、過(guò)表達(dá)PINK1的SKOV3細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的SKOV3細(xì)胞，計(jì)1×104個(gè)細(xì)胞/孔，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。順鉑作用前一天晚上接種96孔板，次日早晨細(xì)胞全部貼壁。用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液稀釋順鉑，終濃度為10 μmol/L和20 μmol/L，200 μL/孔加入到各檢測(cè)點(diǎn)細(xì)胞中，作用0 h、24 h、48 h、72 h及96 h。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期

取轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和PINK1的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106個(gè)。加入預(yù)冷的70%乙醇充分重懸細(xì)胞，置于4 ℃固定細(xì)胞24 h。加入PI避光染色30 min，300鉬濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)每組細(xì)胞周期分布情況。

1.2.7 CountessTM全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析細(xì)胞死亡率

取轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和PINK1的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按4×105/孔的密度接種6孔板，8 h后加入10及20 μmol/L順鉑作用細(xì)胞48 h。收集各組細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色后采用CountessTM(Invetrogen)全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分別計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和死亡細(xì)胞數(shù)，結(jié)果采用CountessTM細(xì)胞死亡率分析軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，各組數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差方式表示。統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢癌細(xì)胞系SKOV3穩(wěn)定表達(dá)PINK1的轉(zhuǎn)染與篩選

pcDNA3.1-PINK1質(zhì)粒經(jīng)大腸桿菌DH5α擴(kuò)增，細(xì)胞裂解法提取質(zhì)粒并純化，經(jīng)Takara寶生物公司測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果用NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)與PINK1基因序列完全一致。

卵巢癌細(xì)胞系SKOV3轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PINK1 48 h后，G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞。篩選30～50 d后，Real-time PCR檢測(cè)PINK1的表達(dá)，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)PINK1的SKOV3細(xì)胞系較正常培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1的SKOV3細(xì)胞比PINK1 mRNA的表達(dá)顯著增高(P<0.05，圖1)。

各組PINK1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，***與SKOV3細(xì)胞和SKOV3-pcDNA3.1組比較，P<0.001圖1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后PINK1的表達(dá)情況Fig 1 PINK1 expression after transfection

2.2 PINK1對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響

MTT結(jié)果顯示，細(xì)胞體外培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h，正常培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒SKOV3-pcDNA3.1組之間細(xì)胞增殖率無(wú)差異(P>0.05，圖2A)，而過(guò)表達(dá)PINK1組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比細(xì)胞增殖率明顯增高，細(xì)胞增殖率分別是接種細(xì)胞數(shù)的(48 h：117.03% vs.88.29%；72 h：167.64% vs.108.20%；96 h：208.33% vs.114.78%，P<0.001，圖2A)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期顯示，過(guò)表達(dá)PINK1組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1及正常培養(yǎng)SKOV3組比G0/G1期細(xì)胞比例降低(55.48% vs. 71.97% vs. 68.91%)，S和G2/M期細(xì)胞比例增加(44.52% vs. 28.03% vs. 31.09%)(P<0.05，圖2B，表2)。

A: SKOV3、SKOV3-pcDNA3.1及SKOV3-PINK1組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，***與SKOV3和SKOV3-pcDNA3.1組比較，P<0.001，n=3；B: SKOV3、SKOV3-pcDNA3.1及SKOV3-PINK1細(xì)胞周期分布圖2 不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖及細(xì)胞周期情況Fig 2 Cell growth, proliferation and cell cycle distribution in different time point

Tab 2 G0/G1, S and G2/M in cell cycle distribution in each group (%)

1)與SKOV3和SKOV3-pcDNA3.1組比較，P<0.05

2.3 PINK1在順鉑誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞死亡中的作用

MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率顯示，低濃度(10 μmol/L)和高濃度(20 μmol/L)順鉑都能夠顯著誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1組細(xì)胞死亡(圖3A)，作用48 h和72 h后兩組細(xì)胞存活率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，分別約為0 h的95%和74%(10 μmol/L DDP)；47%和28%(20 μmol/L DDP)。低濃度順鉑作用過(guò)表達(dá)PINK1組細(xì)胞48 h和72 h，細(xì)胞數(shù)反而較0 h比略有增長(zhǎng)。高濃度順鉑使過(guò)表達(dá)PINK1組細(xì)胞存活率分別為0 h的64.43%(48 h)和41.66%(72 h)，與SKOV3和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1組比，過(guò)表達(dá)PINK1組細(xì)胞在48 h和72 h的存活率顯著增加(P<0.001，圖3A)。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞死亡率(圖3B)，結(jié)果顯示，10 μmol/L順鉑能夠使SKOV3細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1組細(xì)胞死亡率達(dá)到約30%，顯著高于無(wú)順鉑作用的細(xì)胞死亡率(P<0.01，圖3B)。而過(guò)表達(dá)PINK1組在10 μmol/L順鉑作用下細(xì)胞死亡率略增加至22.3%，與無(wú)藥物作用細(xì)胞組比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，圖3B)。高濃度(20 μmol/L)順鉑作用下，SKOV3細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1組和過(guò)表達(dá)PINK1組細(xì)胞死亡率分別為43.6%、45.5%和30.2%，其中過(guò)表達(dá)PINK1組較SKOV3和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1組比，細(xì)胞死亡率顯著降低(P<0.05，圖3B)。

A: 10 μmol/L和20 μmol/L順鉑作用SKOV3、SKOV3-pcDNA3.1及SKOV3-PINK1各組細(xì)胞的存活率，***與SKOV3和SKOV3-pcDNA3.1組比較，P<0.001，n=3；B: 10 μmol/L和20 μmol/L順鉑作用各組細(xì)胞，死亡細(xì)胞比例，*P<0.05，**P<0.01，n=3圖3 過(guò)表達(dá)PINK1，細(xì)胞在10和20 μmol/L順鉑作用下的生長(zhǎng)和死亡情況Fig 3 Analysis of cell growth and death under the exposure of 10 and 20 μmol/LDDP in each group

2.4 過(guò)表達(dá)PINK1增加了順鉑誘導(dǎo)的耐藥基因MDR1、ABCG2和MRP1的表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示20 μmol/L順鉑作用各組細(xì)胞48 h后，過(guò)表達(dá)PINK1組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1組、SKOV3組細(xì)胞相比耐藥基因MDR1(P<0.01)、ABCG2(P<0.001)和MRP1(P<0.05)的表達(dá)顯著提高(圖4)。而無(wú)順鉑作用時(shí)，各組細(xì)胞耐藥基因表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，圖4)。

Real-time PCR檢測(cè)SKOV3、SKOV3-pcDNA3.1及SKOV3-PINK1各組細(xì)胞MDR1、ABCG2和MRP1 mRNA表達(dá)水平，與SKOV3和SKOV3-pcDNA3.1組比較，*** P<0.001，** P<0.01，* P<0.05，n=3圖4 各組MDR1、ABCG2以及MRP1基因的相對(duì)表達(dá)Fig 4 Relative expression of MDR1, ABCG2 and MRP1 gene in each group

3 討 論

PINK1/BRPK是一個(gè)定位于線粒體外膜的絲/蘇氨酸蛋白激酶，其最初是在PTEN缺乏時(shí)出現(xiàn)下調(diào)而被鑒定出的[1]。研究表明，PINK1發(fā)揮著神經(jīng)保護(hù)性作用，其通過(guò)磷酸化線粒體分子伴侶TRAP1，抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損害[2-4]。目前，PINK1在神經(jīng)退行性疾病中的研究極為廣泛，眾多研究顯示，PINK1突變會(huì)導(dǎo)致常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森病[6-8]。

近年研究發(fā)現(xiàn)PINK1的功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其在神經(jīng)組織中的線粒體保護(hù)蛋白的作用[9-10]。實(shí)驗(yàn)證明，PINK1在高轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中表達(dá)升高，在人乳腺癌和肺癌標(biāo)本中存在PINK1胞質(zhì)和胞膜的異常分布[11-12]。PINK1通過(guò)激活PI3K/AKT保護(hù)細(xì)胞免受多種細(xì)胞毒制劑的損害，促進(jìn)腫瘤存活，過(guò)表達(dá)PINK1抑制了多種細(xì)胞毒劑如魚藤酮、順鉑、過(guò)氧化氫、衣霉素、蛋白酶體抑制劑以及氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡[11-12]。并且，PINK1能夠與磷酸化的Bcl-xL(S62)相互作用，并能阻止Bcl-xL N末端促凋亡片段的剪切，抑制了線粒體去極化誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[13]。之外，PINK1成為DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)[14]。下調(diào)PINK1使膀胱癌細(xì)胞對(duì)基因治療的敏感性增加[15]。盡管PINK1在腫瘤中的作用被不斷發(fā)現(xiàn)，其在卵巢腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚未闡明。2014年，劉川等[16]研究發(fā)現(xiàn)在惡性及交界性黏液性上皮性卵巢腫瘤中PINK1的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于良性黏液性上皮性卵巢腫瘤。提示，PINK1與黏液性卵巢癌發(fā)生的相關(guān)性。2016年，Willis等[17]通過(guò)Meta分析篩選出與卵巢癌預(yù)后相關(guān)的32個(gè)基因，其中發(fā)現(xiàn)PINK1基因的高表達(dá)與卵巢癌預(yù)后差高度相關(guān)。以上研究都提示了PINK1在卵巢癌中的潛在作用。

本研究前期工作中，我們利用質(zhì)粒pcDNA3.1-PINK1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞系HO-8910和SKOV3，并以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒為對(duì)照。發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PINK1使HO-8910和SKOV3細(xì)胞增殖率顯著提高，并同時(shí)降低了HO-8910和SKOV3細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑作用的敏感性(P<0.05)。由此表明，PINK1對(duì)多種卵巢癌細(xì)胞的作用具有普遍性。為進(jìn)一步分析PINK1在卵巢癌細(xì)胞中的作用，本研究首先構(gòu)建PINK1穩(wěn)定表達(dá)SKOV3細(xì)胞系，并以其為研究對(duì)象。首先研究PINK1的表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示上調(diào)PINK1的表達(dá)促進(jìn)SKOV3細(xì)胞增殖(P<0.05)，使細(xì)胞周期G0/G1期比例降低，S和G2/M期的比例升高(P<0.05)。10 μmol/L、20 μmol/L順鉑顯著抑制SKOV3細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，而過(guò)表達(dá)PINK1降低了細(xì)胞對(duì)順鉑作用的敏感性(P<0.05)。并且進(jìn)一步檢測(cè)耐藥基因發(fā)現(xiàn)，PINK1使耐藥基因MDR1、ABCG2及MRP1的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。由此分析過(guò)表達(dá)PINK1細(xì)胞對(duì)順鉑作用敏感性降低可能是由于PINK1誘導(dǎo)了耐藥基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)各組均采用轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞以及非轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對(duì)照，排除了質(zhì)粒本身或細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)程的影響。

總之，PINK1與線粒體功能、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、泛素蛋白酶體系統(tǒng)、線粒體相關(guān)性自噬等功能緊密相關(guān)[18-20]，而上述生物學(xué)功能的異常均可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。PINK1作為腫瘤治療和新藥開(kāi)發(fā)的潛在新靶點(diǎn)，為今后靶向藥物研發(fā)提供方向，同時(shí)為卵巢癌臨床的診斷和治療提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

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