丁 立，高寧陽，龐 堅(jiān)，熊軼喆，石印玉

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 骨傷科，上海 200000)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是關(guān)節(jié)炎中最多發(fā)的一種，主要累及膝、髖等大關(guān)節(jié)，以關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性破壞為主要病理特征，是導(dǎo)致中老年人慢性肌肉、骨骼疼痛和功能活動(dòng)障礙的最主要的原因[1]。據(jù)報(bào)道，世界上總?cè)丝诘?9%具有影像學(xué)膝骨關(guān)節(jié)炎證據(jù)[2]。由于骨關(guān)節(jié)炎的復(fù)雜性和難治性，其已成為現(xiàn)今骨傷科學(xué)所面對(duì)的重要醫(yī)學(xué)難題和研究熱點(diǎn)。微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)具有調(diào)節(jié)軟骨發(fā)育及維持軟骨代謝平衡的作用，在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中扮演著重要的角色。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院石印玉教授研制的養(yǎng)血柔肝法中成藥“養(yǎng)血軟堅(jiān)膠囊”已經(jīng)被證實(shí)了具有提高痛閾、抑制炎性反應(yīng)、保護(hù)軟骨等作用，臨床研究也發(fā)現(xiàn)本藥對(duì)緩解OA病人疼痛、改善相關(guān)癥狀具有良好效果[3-6]。本研究探求miRNAs生物學(xué)功能與軟骨代謝的關(guān)系，并觀察養(yǎng)血柔肝法“養(yǎng)血軟堅(jiān)膠囊”作用后的miRNAs表達(dá)水平的變化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及取材

10周齡健康Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，體重200～250 g，雌雄各半。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)為SPF(specific pathogen free，無特定病原體)級(jí)實(shí)驗(yàn)室。大鼠每4只1籠，保證充分活動(dòng)空間，自由飲水、進(jìn)食。

對(duì)大鼠進(jìn)行前交叉切除造模(ACLT)。大鼠造模術(shù)后飼養(yǎng)4周，經(jīng)病理切片、Safranin-O染色、Mankin評(píng)分驗(yàn)證造模成功后。隨機(jī)將40只SD大鼠分為兩組：模型組(n=20，造模，不干預(yù))、中藥組(n=20，造模，藥物干預(yù))，中藥組按大鼠與人體等效劑量折算的養(yǎng)血軟堅(jiān)膠囊(滬藥制字Z04100932)溶液進(jìn)行灌胃給藥，每周6 天(周一至周六)，每天1次。灌胃4周后，兩組大鼠同時(shí)采用 LCM技術(shù)捕獲術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

測(cè)序儀(公司：Illumina，型號(hào)：Hiseq2500)，熒光定量PCR儀(公司：ABI，型號(hào)：ABI7500)。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑

養(yǎng)血軟堅(jiān)膠囊(廠家：上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，貨號(hào)：Z04100932)，TruSeqTMSmall RNA Sample Prep Kits(公司:Illumina)，RNA提取試劑盒(公司：TAKARA，貨號(hào)：9109)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(公司：TAKARA，貨號(hào)：RR036A)，SYBR GREEN kit(公司：ABI，貨號(hào)1504490)。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取

捕獲后的軟骨細(xì)胞勻漿，加1 mL Trizol混勻，靜置15 min，使其充分裂解，然后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管。每1 mL加入200 μL氯仿，加入氯仿，振蕩15 s后，室溫放置 15 min。4 ℃ 14000 r/min 離心 15 min。吸取上層透明水相，至另一離心管中。加入0.5 mL異丙醇充分混勻，室溫靜置15 min。 4 ℃ 14000 r/min離心10 min，棄去上清液，RNA 沉于管底。加入75%乙醇洗滌RNA，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4 ℃ 9500 r/min 離心 5 min，小心吸棄上清。室溫晾干。用 20 mL 1‰DEPC水溶解RNA樣品，室溫靜置30 min。

1.2.2 制備文庫及測(cè)序?qū)嶒?yàn)

提取總RNA后，選取模型組和中藥組每組各3個(gè)樣品，利用miRNAs 5’端為磷酸基團(tuán)，3’端為羥基基團(tuán)的特殊屬性。首先利用T4 RNA Ligase連接酶2(Truncated)將1個(gè)腺苷化單鏈DNA的 3’接頭和5’接頭分別連接到small RNA之上，其中3’端接頭的5’端為rAPP，同時(shí)3’端有氨基起保護(hù)作用，故而能夠在很大程度上減少miRNAs的自連。5’端接頭可以特異性地捕獲5’端為磷酸基團(tuán)的small RNA序列。通過與其3’端互補(bǔ)的RT引物反轉(zhuǎn)錄帶有3’端與5’端鏈接接頭的small RNA 序列，然后使用PCR擴(kuò)增所得的cDNA序列。通過6%polyacrylamide Tris-borate-EDTA 膠回收長度140 bp 堿基的 PCR 產(chǎn)物。

參照說明書，利用Illumina Hiseq2500測(cè)序儀對(duì)已構(gòu)建好的miRNAs測(cè)序文庫進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序讀長設(shè)為單端 1×50 bp。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

使用FASTX工具包(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，去掉3’端接頭序列，再去掉兩端測(cè)序分值<20的堿基序列，過濾掉已經(jīng)去掉30%或以上的測(cè)序序列。過濾的測(cè)序序列用Bowtie工具(Bowtie2 version 2.1.0 http://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie2) 比對(duì)到參考基因組上生成sam文件，只允許每個(gè)reads有1～8個(gè)堿基的錯(cuò)配。過濾sam文件只保留比對(duì)分值>60的序列，去掉比對(duì)分值低的序列。

從miRbase下載最新的人類microRNA序列和位置信息。然后通過perl程序統(tǒng)計(jì)每個(gè)miRNA比對(duì)的序列個(gè)數(shù)。再統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本總的個(gè)數(shù)計(jì)算每個(gè)miRNA的RPKM的值，得到miRNA表達(dá)值矩陣。通過bioconducter 里的Deseq軟件包(Version 1.24.0 http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq.html )對(duì)6個(gè)樣本的RPKM值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和利用鑒定差異表達(dá)的miRNA。選擇閾值為logFC>1，且P<0.01。miRanda[7]鑒定差異表達(dá)的miRNA的靶基因，只挑選align_score> 150。利用DAVID工具對(duì)差異表達(dá)的靶基因進(jìn)行GO的富集分析和pathway富集分析，選擇P<0.05作為顯著性富集的閾值。利用string v10[8]數(shù)據(jù)鑒定蛋白的相互作用，選擇combine score值>0.9。在獲得這些作用網(wǎng)絡(luò)后，使用Cytoscape(v 3.1.0)[9]對(duì)他們進(jìn)行可視化和生成圖片，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.4 miRNA定量驗(yàn)證

在冰上配置反轉(zhuǎn)錄體系的反應(yīng)液(2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μL，miRNA RT Enzyme Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)至20 μL)。移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(42 ℃ for 60 min，95 ℃ for 3 min)。利用相應(yīng)引物進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)(SYBR Premix Ex Taq (2×) 10 μL，F(xiàn)or ward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，cDNA 8 μL)。反應(yīng)條件為:變形:95 ℃ 3 min,退火:95 ℃ 10 s,延伸:60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，miRNA名稱及序列見表1。

表1 miRNA名稱及序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有結(jié)果以均值±SEM值的形式呈現(xiàn)，并制成表格。數(shù)據(jù)所用的統(tǒng)計(jì)分析方法為t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)分析使用的軟件為Graphpad prism (Graphpad Software, San Diego,CA)，P<0.05為顯著性差異的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)的miRNA的鑒定

差異表達(dá)miRNA分析結(jié)果：7個(gè)上調(diào)，28個(gè)下調(diào)，對(duì)所有的差異表達(dá)miRNA做聚類熱圖。見圖1。

control-模型組，case-中藥組，列代表不同的樣品，行代表不同的miRNA，通過顏色變化展示miRNA在不同實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)變化，顏色由紅色-黑色-綠色變化，其中紅色代表低表達(dá)，綠色代表高表達(dá)，差異表達(dá)miRNA在不同實(shí)驗(yàn)條件下表達(dá)變化相同或相似的miRNA聚集成類圖1 差異表達(dá)miRNA的聚類熱圖Fig 1 Clustering image of the miRNA different expression

2.2 差異基因的靶基因鑒定

通過miRanda工具計(jì)算差異表達(dá)miRNA的靶基因。其中7個(gè)上調(diào)miRNA共調(diào)控了1174個(gè)靶基因，28個(gè)下調(diào)miRNA共調(diào)控了2216個(gè)靶基因。上調(diào)的靶基因多在離子、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞增殖等方面起作用。見表2。富集比較顯著的通路包括長期衰減、趨化因子信號(hào)通路等。見圖2。下調(diào)的miRNA靶基因多在離子結(jié)合、細(xì)胞運(yùn)輸?shù)确矫嫫鹱饔谩Ｒ姳?。下調(diào)的miRNA靶基因最顯著的信號(hào)通路包括血管平滑肌收縮，過氧化物酶體增生物激活受體信號(hào)通路，神經(jīng)活性配體受體相互作用等。見圖3。

表2 上調(diào)差異miRNA調(diào)控的靶基因的GO BP富集分析(TOP15)

橫坐標(biāo)為KEGG數(shù)據(jù)庫中KEGG通路的ID及描述，左側(cè)縱坐標(biāo)為富集到該KEGG條目的靶基因的數(shù)目，右側(cè)縱坐標(biāo)為-lg(Pvalue)，P表示該通路中的富集水平的顯著程度，P的取值范圍為[0,1]，越接近于0，表示富集越顯著圖2 上調(diào)miRNA的靶基因KEGG pathway 富集分析結(jié)果圖Fig 2 KEGG pathway enrichment analysis of the differentially regulated miRNA with up regulation

GO號(hào)注釋下調(diào)靶基因數(shù)量P0006811ionbinding4925．15E-110046872metalionbinding4771．32E-100043169cationbinding4821．67E-100015293symporteractivity422．16E-100031420alkalimetalionbinding571．47E-090042802identicalproteinbinding1252．35E-080015294solute：cationsymporteractivity312．99E-080046983proteindimerizationactivity1138．45E-080005275aminetransmembranetransporteractivity262．96E-060019899enzymebinding1005．76E-060046982proteinheterodimerizationactivity556．88E-060019001guanylnucleotidebinding727．85E-060032561guanylribonucleotidebinding727．85E-060008509aniontransmembranetransporteractivity358．74E-060015179L-aminoacidtransmembranetransporteractivity162．00E-05

橫坐標(biāo)為KEGG數(shù)據(jù)庫中KEGG通路的ID及描述，左側(cè)縱坐標(biāo)為富集到該KEGG條目的靶基因的數(shù)目，右側(cè)縱坐標(biāo)為-lg(Pvalue)，P表示該通路中的富集水平的顯著程度，P的取值范圍為[0,1]，越接近于0，表示富集越顯著圖3 下調(diào)miRNA的靶基因KEGG pathway富集分析結(jié)果Fig 3 KEGG pathway enrichment analysis of the differentially regulated miRNA with down regulation

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

上調(diào)miRNA調(diào)控靶基因有Adcy5、Gnai3、Lpar1等。見圖4，表4。下調(diào)miRNA調(diào)控靶基因有Gnb1、Adcy3、Adcy5等。見圖5，表4。這些靶基因多為趨化因子信號(hào)通路、黑素生成等方面起作用。見表5。

每個(gè)圓形節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)靶基因，節(jié)點(diǎn)之間連接線表示兩靶基因之間存在相互作用關(guān)系，靶基因節(jié)點(diǎn)上連接新越多，表示該靶基因節(jié)點(diǎn)連通度越高，越可能是hub基因圖4 上調(diào)miRNA調(diào)控靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 PPI network map of the target genes of the miRNA with up regulation expression

上調(diào)miRNA靶基因連接度下調(diào)miRNA靶基因連接度Adcy536Gnb169Gnai329Adcy356Lpar155Adcy555Cxcr323Adcy655Cxcl1223Pomc47Ccr123Lpar343Ccr722Lpar143Agtr222Ccl943Cxcl1121Ccl643Ccr921Casr43

每個(gè)圓形節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)靶基因，節(jié)點(diǎn)之間連接線表示兩靶基因之間存在相互作用關(guān)系，靶基因節(jié)點(diǎn)上連接新越多，表示該靶基因節(jié)點(diǎn)連通度越高，越可能是hub基因圖5 下調(diào)miRNA的靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 5 PPI network map of the target genes of the miRNA with down regulation expression

通路基因數(shù)量P基因rno04062：Chemokinesignalingpathway137．42E-16ADCY3，GNAI3，ADCY5，CCR1，ADCY6，CCL9，CXCR3，CXCL11，CXCL12，CCL6，CCR9，CCR7，GNB1rno04540：Gapjunction56．52E-05ADCY3，GNAI3，ADCY5，ADCY6，LPAR1rno04916：Melanogenesis51．07E-04ADCY3，GNAI3，ADCY5，ADCY6，POMCrno04060：Cytokine-cytokinereceptorinteraction61．64E-04CCR9，CCR7，CCR1，CXCR3，CXCL11，CXCL12rno04914：Progesterone-mediatedoocytematuration40．001761ADCY3，GNAI3，ADCY5，ADCY6rno05414：Dilatedcardiomyopathy30．026571ADCY3，ADCY5，ADCY6rno04912：GnRHsignalingpathway30．028807ADCY3，ADCY5，ADCY6rno04114：Oocytemeiosis30．039117ADCY3，ADCY5，ADCY6rno04270：Vascularsmoothmusclecontraction30．040412ADCY3，ADCY5，ADCY6

2.4 重要的miRNA調(diào)控靶基因網(wǎng)絡(luò)圖

一些重要的miRNA調(diào)控了比較多的hub 基因，例如miR-140 ,miR-9, miR-15b, miR-223等。見圖6。

橙色圓形節(jié)點(diǎn)為靶基因，藍(lán)色菱形節(jié)點(diǎn)為下調(diào)miRNA，紅色菱形為上調(diào)miRNA，菱形節(jié)點(diǎn)和圓形節(jié)點(diǎn)之間的連接線表示兩節(jié)點(diǎn)之間存在調(diào)控關(guān)系圖6 重要miRNA調(diào)控靶基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig 6 Important miRNA regulatory target gene network map

2.5 RT-PCR驗(yàn)證關(guān)節(jié)軟骨中miRNAs的表達(dá)

關(guān)節(jié)軟骨中，中藥組rno-miR-199a-5p、rno-miR-140-3p的表達(dá)高于模型組，中藥組rno-miR-300-3p、rno-miR-9a-3p的表達(dá)低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而中藥組rno-miR-142-5p、rno-miR-485-5p表達(dá)與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖7。

Model為模型組，Treatment為中藥組，*與模型組相比較， P<0.05圖7 關(guān)節(jié)軟骨中miRNAs的表達(dá)差異Fig 7 Expression levels of miRNA

3 討 論

3.1 養(yǎng)血柔肝法

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院骨傷科石印玉教授根據(jù)骨關(guān)節(jié)炎經(jīng)典理論，結(jié)合自身多年臨床經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)立了養(yǎng)血柔肝法治療骨關(guān)節(jié)炎，療效甚佳。已研制了中成藥——“養(yǎng)血軟堅(jiān)膠囊”。養(yǎng)血軟堅(jiān)膠囊主要由白芍、秦艽、牡蠣等中藥組成，前期試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了養(yǎng)血軟堅(jiān)膠囊可以提高C57黑鼠的痛閾，并具有較強(qiáng)的抑炎作用，其抑炎率分別為66.7%和75%[3]；具有上調(diào)軟骨蛋白多糖核心蛋白基因表達(dá)的作用，但不會(huì)引起軟骨細(xì)胞異常分泌MMP-3[4-6]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)本藥對(duì)緩解OA病人疼痛、改善相關(guān)癥狀具有良好效果。

3.2 相關(guān)miRNAs與骨關(guān)節(jié)炎和養(yǎng)血柔肝法的關(guān)系

近期，隨著對(duì)關(guān)節(jié)軟骨代謝分子機(jī)制的不斷深入了解，已有較多研究認(rèn)為：miRNAs在骨關(guān)節(jié)炎病理過程中對(duì)調(diào)節(jié)軟骨發(fā)育及維持軟骨代謝平衡具有重要作用，是治療骨關(guān)節(jié)炎的新靶點(diǎn)[10]。本課題通過觀察養(yǎng)血柔肝法治療的骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，發(fā)現(xiàn)rno-miR-199a-5p、rno-miR-140-3p、rno-miR-300-3p、rno-miR-9a-3p等的表達(dá)受到調(diào)控。

3.2.1 miR-140

本研究通過測(cè)序技術(shù)以及qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，在養(yǎng)血柔肝法治療的大鼠骨關(guān)節(jié)炎中藥組中，軟骨里的rno-miR-140-3p呈高表達(dá)狀態(tài)，且與模型組有明顯差異。并上調(diào)了Ccr1、Ccr7、Agtr2等因子。

作為第一個(gè)被報(bào)道在斑馬魚、鼠類等動(dòng)物的關(guān)節(jié)軟骨中特異性高表達(dá)的miRNA[11-12]，miR-140在軟骨生長和穩(wěn)定過程中，起到一系列的作用。同時(shí)，人體研究表明，在骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨中的miR-140表達(dá)較正常人關(guān)節(jié)軟骨中的表達(dá)明顯降低，其過度表達(dá)能夠抑制小鼠骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。這與本課題所做的大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。Miyaki等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-140基因敲除的小鼠會(huì)出現(xiàn)軟骨內(nèi)成骨生長缺陷，小鼠四肢短小伴有顱面骨骼畸形，隨著年齡的增長，關(guān)節(jié)軟骨也會(huì)出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎樣改變，說明miR-140參與到了軟骨生長發(fā)育的過程當(dāng)中。Nakamura等[14]在miR-140基因敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)，小鼠軟骨內(nèi)成骨生長發(fā)育速度加快，并判斷這是由于miR-140的缺失致使小鼠的軟骨細(xì)胞加速向肥大軟骨細(xì)胞分化而導(dǎo)致的。以上實(shí)驗(yàn)均說明了miR-140的表達(dá)與軟骨細(xì)胞分化相關(guān)，且IL-1β可以下調(diào)miR-140的表達(dá)以致在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎基因的異常表達(dá)。Karlsen等[15]通過抑制miR-140的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致軟骨生成調(diào)控因子Sox9和aggrecan蛋白表達(dá)水平的下調(diào),且這種下調(diào)不會(huì)引起Sox9和ACAN mRNA的改變。這些實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了miR-140可以和Sox9等軟骨生成調(diào)控因子互相影響，但是具體的調(diào)控機(jī)制需進(jìn)一步研究。miR-140被Sox9激活后可以調(diào)節(jié)Sp1并與Wwp2-c共表達(dá)，進(jìn)而在軟骨退變和骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制上具有重要作用。金屬基質(zhì)蛋白酶13(matrix metalloproteinase，MMP13)、含血小板結(jié)合蛋白的基序的聚蛋白樣金屬蛋白酶5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS5)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白 5(IGFBP5)都是參與關(guān)節(jié)軟骨代謝的重要因子，miR-140可以靶向地對(duì)它們調(diào)控，從而維持關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)定[16]。目前研究已經(jīng)表明，miR-140可以通過調(diào)控TGF-β信號(hào)通路、BMP信號(hào)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路等途徑對(duì)軟骨細(xì)胞的生長進(jìn)行調(diào)控[17]。

3.2.2 miR-199a

從本研究結(jié)果可以看到，與模型組比較在大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中藥組關(guān)節(jié)軟骨樣本里，rno-miR-199a-5p表達(dá)上調(diào)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

研究發(fā)現(xiàn)，在兔骨關(guān)節(jié)炎模型的軟骨下骨中，miR-199-5p的表達(dá)量明顯處于低水平，而軟骨代謝相關(guān)因子MMP-3和IL-1β的表達(dá)量均明顯升高[18]。在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中作為COX-2的調(diào)節(jié)因子，miR-199a與p38-MAPK的激活呈負(fù)相關(guān)，并在軟骨細(xì)胞的代謝中具有重要的調(diào)節(jié)作用，可能是骨關(guān)節(jié)炎新的治療靶點(diǎn)。同時(shí)，miR-199a 是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP2)的響應(yīng)microRNA，其可通過直接靶點(diǎn)SMAD1蛋白負(fù)向調(diào)節(jié)早期軟骨細(xì)胞分化的過程[19]。以往的研究也表明，miR-193b和miR-199a-5p與軟骨細(xì)胞的衰老相關(guān)。

3.2.3 miR-300

本研究中，與模型組比較養(yǎng)血柔肝法治療的大鼠骨關(guān)節(jié)炎中藥組中關(guān)節(jié)軟骨的rno-miR-300-3p表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

根據(jù)本課題測(cè)序?qū)嶒?yàn)，miR-300-3p可以靶向調(diào)節(jié)趨化因子配體6[Chemokine (C-C motif) ligand 6，Ccl6]。作為CC趨化因子，Ccl6會(huì)在炎癥和重構(gòu)疾病中大量產(chǎn)生。這就解釋了大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組的rno-miR-300-3p表達(dá)上調(diào)的原因，而養(yǎng)血柔肝法治療的大鼠骨關(guān)節(jié)炎中藥組中，rno-miR-300-3p在關(guān)節(jié)軟骨中表達(dá)低于模型組，這可能也體現(xiàn)了養(yǎng)血軟堅(jiān)膠囊具有抑制炎癥的功效。

3.2.4 miR-9a

通過本次課題軟骨中miRNAs表達(dá)結(jié)果可以看出，養(yǎng)血柔肝法治療的大鼠骨關(guān)節(jié)炎中藥組在關(guān)節(jié)軟骨中的rno-miR-9a-3p的表達(dá)低于大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在IL-1β和IL-6誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，miR-9可以抑制單核細(xì)胞趨化蛋白誘導(dǎo)蛋白-1(MCPIP1)在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)。MCPIP1是一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的CCCH型鋅指家族分子，可被多種炎性因子激活，可通過下調(diào)IL-6等炎癥因子表達(dá)，從而抑制炎癥過程。同時(shí)，MCPIP1也可負(fù)向調(diào)控NF-κB信號(hào)通路的活化[20]。NF-κB信號(hào)通路的激活會(huì)導(dǎo)致進(jìn)展性的細(xì)胞外基質(zhì)損傷和關(guān)節(jié)軟骨降解。故而中藥組rno-miR-9a-3p相對(duì)于模型組的低表達(dá)，是養(yǎng)血軟堅(jiān)膠囊保護(hù)軟骨和抑制炎癥的重要佐證。

3.2.5 miR-142

本課題中，盡管結(jié)果并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但中藥組的rno-miR-142-5p在關(guān)節(jié)軟骨中低表達(dá)明確，且以往的研究已經(jīng)證實(shí)miR-142在軟骨代謝、炎癥水平方面有一定的調(diào)控作用。

NF-κB信號(hào)通路在關(guān)節(jié)軟骨的生長發(fā)育及骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起到明顯作用[21]，可以調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖凋亡、炎性因子的表達(dá)。研究表明，miR-142可以通過HMGB1調(diào)控NF-κB信號(hào)通路以達(dá)到抑制炎癥和骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的作用。而白芍中的白芍總苷能夠通過下調(diào)TLR-4 / NF-κB的表達(dá)水平來減輕膿毒癥大鼠的炎性反應(yīng)[22]，同時(shí)能夠下調(diào)NF-κB信號(hào)通路的蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型的炎癥反應(yīng)[23]。據(jù)此可以推測(cè)白芍總苷是通過抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)，達(dá)到保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用，從而對(duì)骨關(guān)節(jié)炎起到一定的治療作用。通過以后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)或可解釋養(yǎng)血柔肝法中藥“養(yǎng)血軟堅(jiān)膠囊”的作用機(jī)理。

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