張金堂，沙 迪，夏廣軍，徐紅艷*

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

山核桃（Juglans mandshurica），別名核桃楸、胡桃楸，其葉、樹(shù)皮、根及果實(shí)均可入藥[1-2]，具有抗腫瘤、抑菌、抗氧化等作用[3-4]，在傳統(tǒng)中藥方面應(yīng)用廣泛。黃酮類(lèi)化合物廣泛分布于各種植物[5]，具有良好的生物活性[6-7]，能清除生物體內(nèi)的自由基，同時(shí)具有氧化損傷保護(hù)作用，又具有很多重要的藥理作用，流行病學(xué)調(diào)查也顯示，日常餐飲中黃酮類(lèi)化合物的攝入有益健康并可降低慢性疾病的發(fā)生[8]。

在正常情況下，機(jī)體自由基能維持在損傷閾值以下的平衡態(tài)，但很多因素都能造成機(jī)體的氧化損傷，如乙醇、H2O2、輻射等，使機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量的自由基，引起氧化應(yīng)激[9]。盡管有研究表明，哺乳動(dòng)物的機(jī)體具有某些抵抗和減少氧化損傷的防御機(jī)制，但活性氧自由基高度活化，能夠破壞脂類(lèi)、蛋白質(zhì)和DNA、RNA等生物分子[10]，從而導(dǎo)致癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、組織器官老化、炎性疾病等的發(fā)生[11]，給人類(lèi)健康帶來(lái)很大的潛在危害。

東北山核桃仁營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，近年來(lái)成為研究和關(guān)注的熱點(diǎn)。山核桃殼是加工核桃仁過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，部分用于加工工藝品或制備活性碳，關(guān)于其中活性成分研究報(bào)道較少，而有關(guān)東北山核桃殼黃酮（flavonoids from seed shells of Juglans mandshurica，F(xiàn)SSJM）氧化損傷防御作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SSJM具有顯著的清除2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）和羥自由基作用[12]，基于其顯著的體外抗氧化效果，本研究以東北山核桃殼為原料，提取總黃酮，經(jīng)分級(jí)萃取和柱層析純化提高純度，采用X射線制造氧化損傷模型，并通過(guò)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，采用分光光度法、形態(tài)學(xué)法和免疫組化法，進(jìn)一步探索其體內(nèi)氧化損傷防御作用，旨在為東北山核桃殼生理活性物質(zhì)的深入挖掘和堅(jiān)果加工副產(chǎn)物的應(yīng)用和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供參考及新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

健康雄性SPF級(jí)昆明小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)于延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

FSSJM（純度54%）按本課題組前期研究方法制備[12]。

鹽酸小檗胺片（批號(hào)：151101） 四川中方制藥有限公司；還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）標(biāo)準(zhǔn)品上海源葉生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；兔抗Bax、Bcl-2美國(guó)Cell Signaling Technology公司；鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（streptavidin-biotin complex，SABC）免疫組化染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒 美國(guó)博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Z400K型速凍離心機(jī) 德國(guó)Hermle公司；U-3900型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本日立公司；Elekta CompactTM醫(yī)用直線加速器 醫(yī)科達(dá)北研（北京）醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠輻射誘導(dǎo)氧化損傷模型的建立

將60 只雄性的昆明小鼠隨機(jī)分為6 組，正常組和模型組（0.125%羧甲基纖維素），F(xiàn)SSJM低、中、高劑量組（X射線+100、200、400 mg/（kg·d）），陽(yáng)性對(duì)照組（X射線+鹽酸小檗胺片56 mg/（kg·d））。每3 d測(cè)體質(zhì)量，連續(xù)灌胃14 d后，采用醫(yī)用直線加速器一次性全身X射線照射，源皮距95 cm，劑量吸收率1 Gy/min，照射總劑量4 Gy。

1.3.2 血清及肝勻漿的制備

小鼠X射線照射24 h后，眼球采血，4℃、4 000 r/min離心10 min，上清液4 ℃保存。小鼠處死后迅速取肝臟制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%勻漿，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 抗氧化酶活力的測(cè)定

小鼠肝臟和血清中SOD、GSH-Px、CAT活力的測(cè)定均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.4 MDA含量的測(cè)定

采用硫代巴比妥酸顯色法，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.5 GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及含量測(cè)定

采用5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）法[13]，分別取1 mmol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mL，加三蒸水至0.5 mL，再分別加4.0 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、0.5 mL DTNB試劑，充分混勻，5 min內(nèi)于412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以三蒸水調(diào)零，以GSH含量為x軸，吸光度為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y＝0.013 4x-0.002 8，R2＝0.998 3。將制備好的肝勻漿與20%三氯乙酸溶液2∶1（V/V）混勻，4 000×g離心10 min，收集上清液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定，并計(jì)算樣品中GSH的含量。

1.3.6 形態(tài)學(xué)觀察

X射線照射14 d后處死小鼠，迅速取肝臟，體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定，經(jīng)脫水、透明，石蠟包埋，制為5 μm切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后鏡檢。

1.3.7 免疫組化檢測(cè)

X射線照射14 d后處死小鼠，迅速取肝臟和脾臟，體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，制為4 μm切片，烤片過(guò)夜，脫蠟。然后滴加體積分?jǐn)?shù)3% H2O2溶液，室溫孵育10 min，PBS清洗；滴加5%牛血清白蛋白封閉液，37℃下孵育20 min，甩干；滴加一抗，4 ℃下孵育過(guò)夜，PBS清洗；滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS清洗；滴加SABC，37 ℃孵育30 min，PBS清洗；滴加DAB顯色，蘇木精復(fù)染2 min，脫水，中性樹(shù)膠封片，鏡檢。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 FSSJM對(duì)小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活力及MDA含量的影響

表1 FSSJM對(duì)小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活力及MDA含量的影響Table1 Effect of FSSJM on SOD, GSH-Px and CAT activity and MDA content in serum of mice

由表1可知，與正常組相比，模型組小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活力極顯著降低（P＜0.01），MDA含量極顯著升高（P＜0.01），表明輻射誘導(dǎo)的氧化損傷造模成功。與模型組相比，F(xiàn)SSJM中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組SOD活力極顯著升高（P＜0.01）；低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組GSH-Px活力顯著升高（P＜0.05），中、高劑量組GSH-Px活力極顯著升高（P＜0.01）；中劑量組CAT活力顯著升高（P＜0.05），高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組CAT活力極顯著升高（P＜0.01）；低劑量組MDA含量顯著降低（P＜0.05），中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組MDA含量極顯著降低（P＜0.01）。表明FSSJM能夠調(diào)節(jié)氧化損傷小鼠血清中抗氧化酶活力，并下調(diào)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量。

2.2 FSSJM對(duì)小鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT活力及MDA、GSH含量的影響

表2 FSSJM對(duì)小鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT活力及MDA、GSH含量的影響Table2 Effect of FSSJM on SOD, GSH-Px and CAT activity and MDA and GSH contents in liver of mice

由表2可知，與正常組相比，照射后小鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH含量極顯著降低（P＜0.01），MDA含量極顯著升高（P＜0.01），表明輻射誘導(dǎo)的氧化損傷造模成功。與模型組相比，F(xiàn)SSJM中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的SOD和CAT活力顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）；低劑量組GSH-Px活力顯著升高（P＜0.05），中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組GSH-Px活力極顯著升高（P＜0.01）；低劑量組GSH含量顯著升高（P＜0.05），高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組GSH含量極顯著升高（P＜0.01）。表明FSSJM能夠調(diào)節(jié)氧化損傷小鼠肝臟中抗氧化酶活性，上調(diào)內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)GSH的含量，并下調(diào)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量。

2.3 FSSJM對(duì)小鼠肝臟組織形態(tài)的影響

圖1 FSSJM對(duì)小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化的影響Fig.1 Effect of FSSJM on morphological changes in liver tissues of mice

如圖1A1～F1所示，與正常組比較，模型組細(xì)胞索排列紊亂，細(xì)胞受損嚴(yán)重，肝細(xì)胞大小不一致，出現(xiàn)濃縮壞死現(xiàn)象，導(dǎo)致竇周間隙變大；FSSJM各劑量組均不同程度優(yōu)于模型組，竇周間隙逐漸變小，陽(yáng)性對(duì)照組接近正常組水平。

如圖1A2～F2所示，正常組小鼠肝細(xì)胞大小一致，核結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)明顯病變；模型組肝臟組織細(xì)胞損傷嚴(yán)重，部分細(xì)胞濃縮壞死，界限不清，出現(xiàn)顆粒變性；FSSJM低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)雙核現(xiàn)象，表明細(xì)胞再生，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，竇周間隙變窄；與模型組相比，中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞索排列整齊，核結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞損傷減少。表明FSSJM能夠明顯改善輻照小鼠肝臟組織的損傷。

2.4 FSSJM對(duì)小鼠肝臟Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，正常組肝臟切片未見(jiàn)棕黃色區(qū)域（圖中未能顯示，下同），為Bax蛋白陰性表達(dá)。模型組可見(jiàn)大量棕黃色區(qū)域，且著色較深，為Bax蛋白強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。與模型組相比，F(xiàn)SSJM低、中劑量組Bax蛋白陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組Bax陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)一步減少，且著色較淺、分布均勻，為Bax蛋白陰性表達(dá)。表明FSSJM可下調(diào)輻射誘導(dǎo)的氧化損傷小鼠肝細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)。

圖2 FSSJM對(duì)小鼠肝臟組織Bax蛋白的影響Fig.2 Effect of FSSJM on Bax protein expression in liver tissues of mice

圖3 FSSJM對(duì)小鼠肝臟組織Bcl-2蛋白的影響Fig.3 Effect of FSSJM on Bcl-2 protein expression in liver tissues of mice

如圖3所示，正常組小鼠肝臟組織可見(jiàn)大量棕黃色的Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞，且著色較深，為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；模型組肝臟組織棕黃色明顯變淡，為Bcl-2蛋白弱陽(yáng)性表達(dá)；與模型組相比，F(xiàn)SSJM中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組可見(jiàn)較大面積棕黃色顆粒，為Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)。表明FSSJM可上調(diào)輻射誘導(dǎo)的氧化損傷小鼠的肝細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)。

2.5 FSSJM對(duì)小鼠脾臟Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

圖4 FSSJM對(duì)小鼠脾臟組織Bax蛋白的影響Fig.4 Effect of FSSJM on Bax protein expression in spleen tissues of mice

如圖4所示，正常組脾臟組織未見(jiàn)棕黃色區(qū)域，是Bax蛋白陰性表達(dá)。模型組可見(jiàn)大量棕黃色區(qū)域，且著色較深，為Bax蛋白強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。與模型組比較，F(xiàn)SSJM低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組Bax蛋白陽(yáng)性細(xì)胞不同程度地減少。表明FSSJM可下調(diào)輻射誘導(dǎo)的氧化損傷小鼠脾臟細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)。

圖5 FSSJM對(duì)小鼠脾臟組織Bcl-2蛋白的影響Fig.5 Effect of FSSJM on Bcl-2 protein expression in spleen tissues of mice

如圖5所示，正常組小鼠脾臟組織可見(jiàn)大量棕黃色區(qū)域，為Bcl-2蛋白強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；模型組肝臟組織僅有少數(shù)棕黃色細(xì)胞，為弱陽(yáng)性表達(dá)；與模型組相比，F(xiàn)SSJM低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組均可見(jiàn)不同面積的棕黃色區(qū)域。表明FSSJM可上調(diào)輻射誘導(dǎo)的小鼠脾臟細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)。

3 討 論

X射線照射可電離機(jī)體內(nèi)的水分子，產(chǎn)生過(guò)量自由基，使細(xì)胞發(fā)生氧化損傷[14]，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生不同程度的病理和生化方面的改變[15]，近幾年成為氧化損傷研究中的造模方法之一[16]，照射后，機(jī)體中抗氧化酶活力降低，脂質(zhì)過(guò)所化產(chǎn)物含量升高[17]。SOD、GSH-Px和CAT是機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)清除氧自由基重要的酶[18]。GSH是反映非酶類(lèi)抗氧化防御系統(tǒng)狀態(tài)的一種多能防護(hù)物質(zhì)[19]；MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物[20]。本研究中，模型組血清和肝臟中SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH含量均顯著低于正常組，MDA含量極顯著高于正常組，與Bansal等[21]報(bào)道的小鼠照射后模型組CAT、SOD活力顯著低于正常組、模型組MDA含量高于正常組的結(jié)果一致，表明小鼠氧化損傷模型構(gòu)建成功。

醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，心血管疾病、腫瘤和衰老均與氧化損傷及自由基代謝失調(diào)有關(guān)。近幾年天然植物活性物質(zhì)在氧化應(yīng)激的防護(hù)中逐步得到重視，植物黃酮作為具有強(qiáng)抗氧化作用的多酚類(lèi)物質(zhì)，顯現(xiàn)出良好的效果。研究表明，黃酮類(lèi)化合物對(duì)X射線、60Co γ射線誘導(dǎo)的氧化損傷都表現(xiàn)出顯著的保護(hù)作用[16,22]，可提高輻射后機(jī)體內(nèi)源性抗氧化酶SOD、CAT及GSH-Px的活力、減少DNA損傷和對(duì)輻射敏感細(xì)胞的凋亡、降低細(xì)胞微核率，并調(diào)節(jié)機(jī)體氧化還原作用敏感通路[23]，發(fā)揮良好的氧化損傷保護(hù)作用。本研究中，F(xiàn)SSJM可減緩X射線照射小鼠體質(zhì)量的下降，不同程度地提高X射線照射小鼠體內(nèi)的SOD、GSH-Px、CAT活力，降低MDA含量，增加內(nèi)源抗氧化物質(zhì)GSH的含量，從而使小鼠體內(nèi)抗氧化能力得到增強(qiáng)，這與王文君等[24]的蘆薈黃酮體內(nèi)抗氧化活性的研究結(jié)果一致。表明FSSJM對(duì)輻射誘導(dǎo)的氧化損傷小鼠的抗氧化酶系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)都具有一定的保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，輻射會(huì)導(dǎo)致肝臟組織的退行性變化[25]。本研究顯示FSSJM各劑量組的肝臟組織與模型組相比均得到不同程度的修復(fù)，與陳純琦[26]研究的蕓豆芽菜多酚修復(fù)過(guò)氧化損傷小鼠肝臟的結(jié)果基本一致。Bax是促凋亡因子，Bcl-2能夠與自身或Bax分別形成同二聚體和異二聚體，從而對(duì)細(xì)胞的凋亡過(guò)程進(jìn)行抑制[27]。研究顯示，X射線照射會(huì)上調(diào)Bax蛋白表達(dá)、下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，促使細(xì)胞凋亡，而植物黃酮具有下調(diào)Bax蛋白和上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)的作用[28]。本研究中模型組肝臟、脾臟細(xì)胞Bax蛋白高表達(dá)，Bcl-2蛋白低表達(dá)，F(xiàn)SSJM各劑量組肝臟、脾臟細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)明顯低于模型組，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于模型組，表明FSSJM通過(guò)下調(diào)Bax和上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，從而有效保護(hù)小鼠肝臟和脾臟細(xì)胞遭受氧化損傷。

以上結(jié)果表明，F(xiàn)SSJM通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)的機(jī)能、抑制細(xì)胞凋亡、修復(fù)受損的肝臟和脾臟組織而發(fā)揮氧化損傷的防御作用。

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