于 戈，王 麗，胡欣蕾，孫亞男，張 欣，李 銘，李文香*

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109）

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militarys）又名北冬蟲(chóng)夏草、北蟲(chóng)草，是由蛹蟲(chóng)草真菌寄生于鱗翅目昆蟲(chóng)的蛹而獲得的子座、菌核復(fù)合體，在我國(guó)主要分布于華北、西南等海拔200～2 000多米的針闊混交林中[1-2]。蛹蟲(chóng)草的活性成分、藥理功效可與享有“千年國(guó)藥”、“藥中之王”美譽(yù)的冬蟲(chóng)夏草（Cordyceps sinensis）相媲美，蛹蟲(chóng)草保健啤酒、口服液等產(chǎn)品越來(lái)越被人們所認(rèn)可[3-4]。

研究發(fā)現(xiàn)，蟲(chóng)草素以腺苷為直接前體進(jìn)行合成，二者結(jié)構(gòu)極其相似且同屬核苷類物質(zhì)，是蛹蟲(chóng)草中重要的活性成分[5]。腺苷具有改善心腦血液循環(huán)、松弛血管平滑肌、防止心率失常等生理活性，是深層大腦刺激效果的關(guān)鍵，可用來(lái)治療帕金森癥和嚴(yán)重震顫患者。蟲(chóng)草素是第一個(gè)從真菌中分離出來(lái)的核苷類抗菌素，在抑菌、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、降血脂、抗血小板凝集、改善記憶力等方面發(fā)揮作用[6-9]。蛹蟲(chóng)草的人工培育已經(jīng)實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，其中以大米等谷物為固態(tài)培養(yǎng)基生產(chǎn)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的方式最為成熟，而在實(shí)際生產(chǎn)中，選育出的蛹蟲(chóng)草菌株使用較短時(shí)間就會(huì)出現(xiàn)退化減產(chǎn)甚至不產(chǎn)子實(shí)體等現(xiàn)象，影響生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。若利用菌絲體階段的蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物為原料開(kāi)發(fā)蛹蟲(chóng)草產(chǎn)品，則能避免子實(shí)體減產(chǎn)帶來(lái)的影響。有研究報(bào)道顯示[10-12]，蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中含有豐富的核苷類物質(zhì)，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。

啤酒糟是啤酒生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物，約占總副產(chǎn)物的85%[13]，僅2012年我國(guó)啤酒糟的產(chǎn)量就超過(guò)1 000萬(wàn) t。啤酒糟中含有豐富的膳食纖維和蛋白質(zhì)，而我國(guó)對(duì)啤酒糟的綜合利用效率偏低，一般被用作飼料，有些甚至作為廢棄物被扔掉，既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境[14]。單一使用大米作蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵原料，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后容易吸水脹裂、黏連結(jié)塊，導(dǎo)致培養(yǎng)基離散度差，影響透氣性和比表面積，不利于菌絲的生長(zhǎng)[15]。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，在大米中加入適量啤酒糟能夠有效改善發(fā)酵原料的物理性狀，促進(jìn)蛹蟲(chóng)草菌絲體生長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)以大米、啤酒糟共培養(yǎng)的蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物為原料，采用熱水浸提法綜合提取腺苷、蟲(chóng)草素，通過(guò)Box-Behnken Design（BBD）優(yōu)化提取工藝參數(shù)，以期提高蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中腺苷、蟲(chóng)草素的得率，為蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的高效利用提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲(chóng)草為來(lái)自錦州的草頭6-1，由山東省蠶業(yè)研究所提供。

蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品 麥克林生化科技有限公司；腺苷標(biāo)準(zhǔn)品 索萊寶生物科技有限公司；乙醇（分析純）康德化工有限公司；甲醇（色譜純） 美國(guó)Honeywell公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1100液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；DK-626恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LFP-800T多功能粉碎機(jī) 浙江榮浩工貿(mào)有限公司；TGL-16C離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；XC-110A超聲清洗機(jī) 濟(jì)寧鑫欣超聲電子設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵產(chǎn)物及樣品的制備

蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物：將8 mL蛹蟲(chóng)草液體菌種接種于經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121 ℃，1 h）過(guò)的大米、啤酒糟混料培養(yǎng)基（大米20 g、啤酒糟20 g、水40 mL）中，于23 ℃培養(yǎng)至菌絲體布滿培養(yǎng)基。

樣品溶液：將蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物于60 ℃烘箱中烘干至質(zhì)量恒定，粉碎、過(guò)80 目篩后取2 g置于100 mL燒杯中，使用恒溫水浴鍋浸提，取上清液經(jīng)離心（3 000 r/min、10 min）、0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后檢測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液：準(zhǔn)確稱取蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，加入25 mL超純水振蕩溶解，制成蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，將蟲(chóng)草素儲(chǔ)備液稀釋至0.005、0.01、0.05、0.1 mg/mL和0.3 mg/mL制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱取25 mg腺苷標(biāo)準(zhǔn)品，加入25 mL的50%乙醇溶液振蕩溶解，制成腺苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，將腺苷儲(chǔ)備液稀釋至0.005、0.01、0.05、0.1 mg/mL和0.3 mg/mL制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Xtimate C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流動(dòng)相：甲醇-水；進(jìn)樣量：5 μL；流速：1 mL/min；流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 高效液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for high performance liquid chromatography

1.3.3 單因素試驗(yàn)

各因素固定值分別為純水提取、液料比30∶1（mL/g）、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間60 min，保持其他3 個(gè)因素不變，每次改變1 個(gè)因素，設(shè)計(jì)提取時(shí)間分別為20、40、60、80、100、120、140 min；乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)分別為0%、10%、20%、30%、40%、50%；液料比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）；提取溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃，外標(biāo)法測(cè)定蟲(chóng)草素與腺苷提取得率，二者之和即為綜合得率。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用BBD設(shè)計(jì)方案，以提取溫度（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）為考察變量，以蟲(chóng)草素和腺苷的綜合得率為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，確定最佳提取工藝。每一變量的低、中、高水平分別以-1、0、1編碼，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for response surface analysis

1.4 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)測(cè)定3 次，取平均值，利用Origin 8.0繪圖；響應(yīng)面試驗(yàn)用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)并對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜測(cè)定結(jié)果

2.1.1 色譜峰歸屬

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（a）和樣品（b）高效液相色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms of standard substance (a) and sample (b)

由圖1a可知，腺苷、蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間分別為13.917、15.959 min。以蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品和腺苷標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為依據(jù)，確定樣品中腺苷和蟲(chóng)草素色譜峰。由圖1b可知，樣品色譜峰分離良好，表明在所用檢測(cè)條件下可同時(shí)測(cè)定腺苷、蟲(chóng)草素含量。

2.1.2 線性關(guān)系考察

取蟲(chóng)草素、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品按0.005、0.01、0.05、0.1 mg/mL和0.3 mg/mL質(zhì)量濃度樣品依次進(jìn)樣，分別測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：蟲(chóng)草素：Y=59 682X+421.97，R2=0.998 9；腺苷：Y=59 878X+72.115，R2=0.999 7。表明腺苷、蟲(chóng)草素在0.005～0.3 mg/mL之間呈良好線性關(guān)系。

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定腺苷、蟲(chóng)草素峰面積，結(jié)果腺苷、蟲(chóng)草素峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.49%、0.61%，表明精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照1.3.1節(jié)方法重復(fù)制備6 份樣品溶液，測(cè)定腺苷、蟲(chóng)草素得率，結(jié)果腺苷、蟲(chóng)草素峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.35%、1.49%，均小于2%表明重復(fù)性良好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)得率的影響

圖2 提取時(shí)間對(duì)蟲(chóng)草素、腺苷得率的影響Fig. 2 Effect of extraction time on the yields of cordycepin and adenosine

由圖2可知，當(dāng)提取時(shí)間小于80 min時(shí)，蟲(chóng)草素得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，在80 min時(shí)，蟲(chóng)草素得率達(dá)到最大為2.055‰；當(dāng)提取時(shí)間小于120 min時(shí)，腺苷得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，在120 min時(shí)，腺苷得率最大為0.324‰，之后隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。提取時(shí)間較短時(shí)以蟲(chóng)草素、腺苷從原料向溶劑中擴(kuò)散為主，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)引發(fā)蟲(chóng)草素、腺苷的降解、吸附[16]。二者的綜合得率在80 min時(shí)達(dá)到最高為2.368‰，因而選擇60～100 min為進(jìn)一步考察條件。

2.2.2 乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響

圖3 乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)蟲(chóng)草素、腺苷得率的影響Fig. 3 Effect of ethanol concentration on the yields of cordycepin and adenosine

由圖3可知，隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增大，蟲(chóng)草素、腺苷得率逐漸降低。乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為0%時(shí)蟲(chóng)草素、腺苷得率最高，分別為1.906‰、0.305‰，綜合得率為2.211‰，因此選擇純水作溶劑。究其原因，可能是隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增大，脂溶性雜質(zhì)的成分溶出量增加，可與乙醇-水分子結(jié)合，為蟲(chóng)草素、腺苷的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，導(dǎo)致蟲(chóng)草素、腺苷得率降低[17]。

2.2.3 液料比對(duì)得率的影響

在這寒風(fēng)漸緊的冬天，親友重逢，或是佳人相會(huì)，舉一杯雙桶陳釀的美酒，品味威士忌陳年酒桶的特別風(fēng)味，把最獨(dú)特的馥郁香醇送給最珍惜的人，何其樂(lè)哉！或者夜深人靜時(shí)，一個(gè)人在靜靜獨(dú)酌，品味時(shí)間的味道，感受那一刻的歲月靜好。

圖4 液料比對(duì)蟲(chóng)草素、腺苷得率的影響Fig. 4 Effect of solvent-to-solid ratio on the yields of cordycepin and adenosine

由圖4可知，液料比對(duì)得率的影響較大。當(dāng)液料比在10∶1～20∶1（mL/g）范圍內(nèi)，蟲(chóng)草素得率隨液料比的增大而升高，由1.716‰升高到2.011‰，若液料比繼續(xù)增大，蟲(chóng)草素得率隨之下降；液料比在10∶1～30∶1（mL/g）范圍內(nèi)時(shí)，腺苷得率隨液料比的增大而升高，由0.206‰升高到0.293‰，液料比繼續(xù)增大，腺苷得率呈下降趨勢(shì)。液料比過(guò)大不但會(huì)降低蟲(chóng)草素、腺苷得率，還會(huì)給后續(xù)濃縮提純帶來(lái)不便。在液料比為20∶1（mL/g）時(shí)，蟲(chóng)草素與腺苷的綜合得率最高達(dá)2.279‰，因而選擇液料比10∶1～30∶1（mL/g）進(jìn)一步考察。

2.2.4 提取溫度對(duì)得率的影響

圖5 提取溫度對(duì)蟲(chóng)草素與腺苷得率的影響Fig 5 Effect of temperature on the yields of cordycepin and adenosine

由圖5可知，溫度對(duì)得率的影響較明顯，在30～50 ℃范圍內(nèi)，蟲(chóng)草素得率隨溫度升高而增大，50 ℃時(shí)蟲(chóng)草素得率達(dá)到最高達(dá)2.083‰；在30～40 ℃范圍內(nèi)腺苷得率隨溫度升高而增大，40 ℃時(shí)腺苷得率達(dá)到最大為0.365‰，之后隨溫度的升高而降低。這可能是因?yàn)榈蜏貢?huì)降低蟲(chóng)草素、腺苷的溶出速率，而溫度過(guò)高會(huì)使蟲(chóng)草素與腺苷的結(jié)構(gòu)遭到破壞[18]。在50 ℃時(shí)綜合提取得率最高，為2.443‰，因此進(jìn)一步考察范圍選擇40～60 ℃。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與回歸方程擬合

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and results with response variables

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取溫度（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）3 個(gè)因素為自變量，以腺苷和蟲(chóng)草素2 種核苷類物質(zhì)綜合得率（Y）為響應(yīng)值繼續(xù)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。采用響應(yīng)面軟件Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)BBD試驗(yàn)方案，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，見(jiàn)表3。經(jīng)擬合回歸，得到綜合得率Y對(duì)自變量A、B、C的回歸方程為：Y=2.45-0.068A+0.11B+0.037C-0.014AB-0.12AC-0.052BC-0.12A2-0.20 B2-0.11C2。

2.3.2 模型方差及可信度分析

通過(guò)表4可知，此模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.000 1），且失擬項(xiàng)不顯著（P=0.854 1＞0.05）。在一次項(xiàng)中，提取溫度（A）、液料比（B）的P值小于0.01，對(duì)綜合得率的影響極顯著；提取時(shí)間（C）的P值為0.020 1（0.01＜P＜0.05）對(duì)綜合得率的影響顯著。交互項(xiàng)中，提取溫度與提取時(shí)間（AC）對(duì)綜合得率的影響達(dá)到極顯著水平（P=0.000 3＜0.001）；液料比與提取時(shí)間（BC）對(duì)綜合得率的影響達(dá)到顯著水平（P=0.02＜0.05）。二次項(xiàng)均對(duì)綜合得率有極顯著影響。

表4 回歸模型方差及可信度分析Table 4 Analysis of variance and reliability of regression model

2.3.3 交互作用分析結(jié)果

圖6 各因素交互作用對(duì)綜合得率影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig. 6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of three process parameters on the total yield of cordycepin and adenosine

由圖6可知，綜合得率隨提取溫度、液料比、提取時(shí)間的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明該模型具有極大值。響應(yīng)面的陡峭程度隨液料比、提取溫度的變化起伏較大，等高線沿液料比、提取溫度軸向變化相對(duì)密集，而沿提取時(shí)間軸向變化相對(duì)稀疏，說(shuō)明液料比、提取溫度對(duì)綜合得率的影響大于提取時(shí)間。提取溫度與提取時(shí)間的等高線圖呈現(xiàn)明顯橢圓形，表明提取溫度與提取時(shí)間的交互作用較強(qiáng)。以上分析與表4中方差分析結(jié)論一致。

2.3.4 工藝參數(shù)優(yōu)化驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)回歸方程的3 個(gè)自變量A、B、C分別求一階偏導(dǎo)，解三元一次方程組得最大得率時(shí)的最優(yōu)組合為提取溫度45.07 ℃、液料比22.42∶1（mL/g）、提取時(shí)間87.36 min，該條件下的預(yù)測(cè)值為2.487‰。在實(shí)際操作中將提取條件修正為提取溫度45 ℃、液料比22∶1（mL/g）、提取時(shí)間87 min，3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值為2.491‰，與預(yù)測(cè)值基本一致，表明優(yōu)化結(jié)果合理、可靠，可以用來(lái)指導(dǎo)蟲(chóng)草素、腺苷的提取。

3 討 論

響應(yīng)面與等高線圖可直觀體現(xiàn)出試驗(yàn)因素與響應(yīng)值的關(guān)系，響應(yīng)面坡度越陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)于操作條件的改變?cè)矫舾?，該因素?duì)綜合得率的影響越大[19]；等高線形狀可反映因素間交互作用強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用較強(qiáng)，圓形則與之相反[20]。

提取時(shí)間對(duì)蟲(chóng)草素與腺苷得率的影響是重點(diǎn)考察因素之一。從單因素結(jié)果來(lái)看，蟲(chóng)草素的最佳提取時(shí)間為80 min，腺苷最佳提取時(shí)間為120 min；響應(yīng)面綜合提取優(yōu)化結(jié)果為87 min。部分報(bào)道[21-23]表明蟲(chóng)草素提取時(shí)間在3～6 h蟲(chóng)草素得率開(kāi)始出現(xiàn)下降；但也有學(xué)者[24-25]的優(yōu)化結(jié)果則顯示蟲(chóng)草素得率在60 min時(shí)較高。腺苷的提取研究中同樣存在最佳提取時(shí)間相差較大的問(wèn)題[26-27]?，F(xiàn)階段研究中，提取蟲(chóng)草素、腺苷等核苷類物質(zhì)的工藝參數(shù)存在較大差異，主要原因是所用原料差別較大，包括子實(shí)體和菌絲體的差異、菌種的差異、培養(yǎng)基和前處理的差異。相對(duì)而言，從蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的菌絲體中提取比從子實(shí)體中提取所用時(shí)間短；在一定范圍內(nèi)，原料粉碎粒度小更容易提取。

提取溫度也會(huì)對(duì)提取時(shí)間產(chǎn)生明顯影響，較高的提取溫度不僅能加速溶劑對(duì)原料的浸潤(rùn)、增加傳質(zhì)速率，而且還可以提高溶質(zhì)的溶解度[28]。本實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)面分析顯示提取溫度與提取時(shí)間的交互作用達(dá)到極顯著水平，也驗(yàn)證了提取時(shí)間與提取溫度在浸提時(shí)的相互影響。綜合得率最高時(shí)的提取溫度為45 ℃，可見(jiàn)蟲(chóng)草素、腺苷的提取并不需消耗太多能源，過(guò)高的溫度反而會(huì)使提取得率迅速下降，這與大多數(shù)研究結(jié)論相符[29-30]。

本實(shí)驗(yàn)采用浸提法綜合提取蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的蟲(chóng)草素、腺苷，該方法技術(shù)成熟、所需設(shè)備簡(jiǎn)單、能源消耗少、不需要使用有機(jī)溶劑，減少對(duì)環(huán)境的污染，在生產(chǎn)上具有較高的實(shí)用價(jià)值，為后續(xù)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供一定參考基礎(chǔ)。

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