李廷躍 吳帆

暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州紅十字會(huì)醫(yī)院/廣州紅十字會(huì)醫(yī)院普通外科（廣州 510220）

高內(nèi)涵篩選（high content screening，HCS）是一種以細(xì)胞為檢測(cè)對(duì)象，通過顯微成像法記錄多孔板內(nèi)細(xì)胞的圖像并通過分析圖像中的信息來解析細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)活動(dòng)的技術(shù)工具［1］。該技術(shù)系在高通量篩選（high throughput screening，HTS）技術(shù)興起后逐步發(fā)展而來，主要依賴于高分辨率的細(xì)胞成像系統(tǒng)，充分整合樣品制備技術(shù)、自動(dòng)化設(shè)備、數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)、檢測(cè)試劑、生物信息學(xué)等資料的優(yōu)勢(shì)，在細(xì)胞或分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞信號(hào)發(fā)送、信號(hào)傳導(dǎo)、信號(hào)接收及相關(guān)一系列反應(yīng)的成像、分析及篩選［1］。HTS技術(shù)結(jié)果單一［2］，而HCS技術(shù)可在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整的條件下，同時(shí)監(jiān)測(cè)被篩選藥品對(duì)細(xì)胞生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)環(huán)境的影響，涉及膜受體、胞內(nèi)成分、細(xì)胞器和離子通道等眾多靶點(diǎn)，從而能夠得到多方面的篩選結(jié)果［3］。由此可見，HCS技術(shù)可從單一實(shí)驗(yàn)中獲得大量分子機(jī)制相關(guān)的信息，從而在近年來的分子機(jī)制研究中得到了廣泛應(yīng)用。

1 實(shí)現(xiàn)小規(guī)模向大規(guī)模細(xì)胞生物學(xué)研究的飛躍

高內(nèi)涵篩選未出現(xiàn)之前，運(yùn)用熒光顯微技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究仍處于小規(guī)模時(shí)期。所謂小規(guī)模細(xì)胞生物學(xué)的定義，即指運(yùn)用顯微成像系統(tǒng)從較少數(shù)量的實(shí)驗(yàn)樣品中收集圖像數(shù)據(jù)［4］。通常每份實(shí)驗(yàn)樣品的細(xì)胞總數(shù)為10～1 000個(gè)。這些系統(tǒng)需要大量的人工操作以滿足以下4個(gè)條件：（1）維持最理想的光照；（2）試驗(yàn)裝置和裝載細(xì)胞進(jìn)入小的試驗(yàn)環(huán)境；（3）集中掃描；（4）圖像采集、顯示、加工、分析。由于對(duì)手工或從圖像半自動(dòng)數(shù)據(jù)析取的數(shù)據(jù)所產(chǎn)生的信息的處理是一個(gè)密集型勞動(dòng)的過程，故想從這些實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生新的知識(shí)，需要在數(shù)周甚至數(shù)月的時(shí)間里完成許許多多小規(guī)模實(shí)驗(yàn)。這往往需要耗費(fèi)大量的人力物力。再者，雖然這樣的小規(guī)模細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)有助于深刻理解細(xì)胞分子功能，但這些實(shí)驗(yàn)的利用率很低，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)研究的進(jìn)展甚至限制實(shí)驗(yàn)的繼續(xù)進(jìn)行。而這樣的研究之所以只能在小規(guī)模范圍內(nèi)完成，主要是因?yàn)橐酝募?xì)胞生物學(xué)試驗(yàn)尚未能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化（如無法進(jìn)行自動(dòng)化分析設(shè)計(jì)、圖像采集、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)等等）［5］。

但隨著高內(nèi)涵篩選的出現(xiàn)，它將定量的熒光顯微技術(shù)施之于自動(dòng)化的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，使得大規(guī)模細(xì)胞生物學(xué)研究成為可能。而且，在高內(nèi)涵篩選的支持下，大規(guī)模細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)已取得不少成就。高內(nèi)涵篩選是一項(xiàng)研究多個(gè)細(xì)胞陣列中所包含的豐富的細(xì)胞生物學(xué)信息的自動(dòng)化技術(shù)。其自動(dòng)化過程涵蓋了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)、樣品制備、圖像采集、歸檔、處理、分析以及細(xì)胞信息發(fā)掘等多個(gè)過程，達(dá)到了真正意義上的“高內(nèi)涵”。“高內(nèi)涵”即指細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能完整的情況下，其生長分化等過程中的所有信息。

大規(guī)模生物學(xué)實(shí)驗(yàn)同樣包括了若干變量的不同，比如細(xì)胞種類、基質(zhì)的化學(xué)過程、競(jìng)爭(zhēng)者或者對(duì)抗者的濃度、治療時(shí)間、每個(gè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞參數(shù)的種類、時(shí)間點(diǎn)的計(jì)數(shù)和頻率等。在這些實(shí)驗(yàn)中，通過使用完整細(xì)胞制成的高度相關(guān)的測(cè)量工具可以快速地分析其路徑。甚至，在群體里面的每個(gè)真實(shí)獨(dú)立的個(gè)體的多種細(xì)胞活動(dòng)都可以被檢測(cè)到［6］。即活的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所提供的機(jī)制學(xué)研究需要的細(xì)節(jié)完全不受影響，效果顯著。另外，通過這種大規(guī)模細(xì)胞生物學(xué)試驗(yàn)，還可以快速地了解到，某個(gè)特定細(xì)胞過程中整個(gè)生物體水平的表型變化［7］。

高內(nèi)涵篩選使大規(guī)模細(xì)胞生物學(xué)成為可能［4］，從而使得機(jī)制學(xué)的研究變得更加便捷，進(jìn)而給予分子機(jī)制研究必要的條件及助力。如借助高內(nèi)涵篩選可得到抑制或促進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)的某些目的基因，進(jìn)而達(dá)到實(shí)現(xiàn)研究分子機(jī)制的目標(biāo)。其目標(biāo)包括尋找到?jīng)Q定路徑的組件、決定給出的路徑所在的細(xì)胞生理過程的先后順序、證實(shí)治療方案的分子靶點(diǎn)等等。

2 HCS將分子機(jī)制研究帶入一個(gè)更深的研究層次

蛋白質(zhì)組學(xué)和細(xì)胞組學(xué)研究依賴于分析生物化學(xué)事件中的分子視野。而這些分子視野的獲得則需要依賴先進(jìn)的定量顯微技術(shù)，如熒光壽命成像顯微技術(shù)（fluores?cence lifetime imaging microscopy，F(xiàn)LIM）和福斯特共振能量轉(zhuǎn)移成像（forster resonance energy transfer imaging，F(xiàn)RE?TI）。分子水平檢測(cè)到的光譜信息，可用于估計(jì)細(xì)胞形態(tài)、分析細(xì)胞定位、識(shí)別分子或細(xì)胞亞群。由此，獲取特定環(huán)境下細(xì)胞對(duì)化學(xué)和物理刺激反應(yīng)的分子機(jī)制成為可能，即自動(dòng)化熒光壽命成像顯微設(shè)置的無人監(jiān)管操作和成像分析可與這些技術(shù)所提供的高內(nèi)涵相結(jié)合，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞反應(yīng)的分子機(jī)制進(jìn)行分析。

過去10年的研究已證明，F(xiàn)RETI和FLIM技術(shù)對(duì)單個(gè)細(xì)胞中生物化學(xué)狀態(tài)的定量成像起著重要作用。這些成像方法有助于對(duì)不同細(xì)胞總體進(jìn)行分析。定量多參數(shù)顯微技術(shù)是一個(gè)非常年輕的領(lǐng)域。在該領(lǐng)域中，不斷進(jìn)步的液態(tài)樣品處理機(jī)器人技術(shù)和信息技術(shù)正逐漸集成到自動(dòng)化的顯微技術(shù)中，并通過自動(dòng)化和無監(jiān)督操作將高內(nèi)涵圖像信息與高通量容量合二為一。

高內(nèi)涵應(yīng)用程序主要用來對(duì)影響細(xì)胞行為的物質(zhì)或條件進(jìn)行定量和多參數(shù)分析。舉例來講，對(duì)疾病分子機(jī)制的理解就需要高分辨率的信息，因?yàn)樗Y選的目標(biāo)是細(xì)胞和（或）亞細(xì)胞水平的。高內(nèi)涵應(yīng)用程序旨在監(jiān)測(cè)分子路徑：如生物分子的定位、相互作用以及它們對(duì)藥物或病原體的反應(yīng)等。無人監(jiān)管的自動(dòng)熒光壽命成像技術(shù)為可升級(jí)篩選平臺(tái)提供了基礎(chǔ)，使高通量水平和高內(nèi)涵篩選得以合而為一，推動(dòng)了分子機(jī)制研究朝更深層次邁進(jìn)［8］。

3 HCS涉及廣闊的研究領(lǐng)域

3.1 HCS和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo) 在藥物研發(fā)進(jìn)程中，了解環(huán)境因素如何觸發(fā)特定的生物學(xué)瀑布式反應(yīng)是治療控制的關(guān)鍵。因此，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是篩選靶向藥物的主要來源。而借助HCS可以更好地理解新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)通過怎樣的途徑發(fā)揮作用［9］，進(jìn)而為藥物研發(fā)提供方向和依據(jù)。

3.2 HCS和腫瘤學(xué) HCS技術(shù)很早就被用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡和增殖，從而使其在腫瘤研究中占據(jù)了一席之地。實(shí)際上，HCS技術(shù)對(duì)細(xì)胞周期，轉(zhuǎn)化和遷移的檢測(cè)中也具有重要作用。比如，通過改變HCS應(yīng)用程序中的自動(dòng)力試驗(yàn)算法并采用相應(yīng)的試劑盒，HCS便可用于評(píng)估腫瘤的轉(zhuǎn)移潛力，甚至觀察單個(gè)細(xì)胞的變化規(guī)律，有助于更好的理解抗腫瘤化合物如何與眾不同地影響癌細(xì)胞［10］以及檢測(cè)出腫瘤生物標(biāo)記物的功能。

3.3 HCS和神經(jīng)生物學(xué) 在HCS的早期發(fā)展中，人們意識(shí)到成像技術(shù)在神經(jīng)元形態(tài)定量上具有較大的應(yīng)用潛能，因此HCS技術(shù)最早被運(yùn)用于監(jiān)控神經(jīng)突的增長。如今，HCS在各種各樣的神經(jīng)疾病狀態(tài)的研究中應(yīng)用非常廣泛。無論是對(duì)生物學(xué)的基礎(chǔ)研究、新模型的構(gòu)建，抑或是用于干預(yù)治療的小分子的篩選，HCS都有著廣泛的應(yīng)用，其應(yīng)用實(shí)例包括阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮性側(cè)索硬化以及日益增多的腦癌研究等［11］。

3.4 HCS和體外毒性 從某種程度上來講，不論體外毒性是與周圍環(huán)境還是與化學(xué)因素有關(guān)，考慮到HCS技術(shù)觀察的是細(xì)胞對(duì)刺激的表型反應(yīng)，因此所有HCS試驗(yàn)均可被視為“毒性”試驗(yàn)。從相對(duì)簡(jiǎn)單的精確毒性測(cè)量，如細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞變圓，到更加特別的細(xì)胞健康的測(cè)量，HCS可以被應(yīng)用于多種“毒性”研究中，尤其可在多重端點(diǎn)歸一化的多參數(shù)試驗(yàn)中幫助定義微妙的毒性狀態(tài)［12］。

高內(nèi)涵篩選在分子機(jī)制研究中涉及的種種領(lǐng)域以及其過程中所產(chǎn)生的思考和思路，直接或間接使得分子機(jī)制研究變得更為多樣化和全面化，同時(shí)也為分子機(jī)制研究提供了多重研究靈感及價(jià)值［13］。

4 高內(nèi)涵篩選在肝癌靶向治療研究中的作用

4.1 背景 肝癌是嚴(yán)重威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一。根據(jù)全球癌癥狀況最新數(shù)據(jù)（Globocan 2012）的估計(jì)，肝癌已經(jīng)位居全球惡性腫瘤死亡的第2位，2012年全球肝癌死亡病例約為74.6萬例，其中超過50%的肝癌死亡病例發(fā)生于我國［14］。盡管近年來肝癌手術(shù)切除率已明顯提高，肝癌的治療手段已趨于多樣化，但因臨床發(fā)現(xiàn)的肝癌仍以中晚期肝癌為主，這些患者發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已無手術(shù)機(jī)會(huì)，但又缺乏有效的綜合治療手段，從而限制了肝癌整體治療水平的進(jìn)一步提高［15］。近年來，以索拉菲尼為主要代表的分子靶向治療成為肝癌綜合治療領(lǐng)域中的重要進(jìn)展［16］。但索拉菲尼往往在短期治療后即產(chǎn)生耐藥，且其耐藥機(jī)制目前尚不清楚，導(dǎo)致這一問題的原因可能就在于索拉菲尼本身發(fā)揮治療作用的分子機(jī)制目前尚不明確，由此可見，進(jìn)一步篩選潛在的肝癌治療靶點(diǎn)并闡明其增殖凋亡作用機(jī)制，是提高肝癌靶向治療療效以及進(jìn)一步提高肝癌整體治療水平的關(guān)鍵［17-18］。

4.2 應(yīng)用 高內(nèi)涵篩選借助高分辨率的細(xì)胞成像系統(tǒng)，充分整合樣品制備技術(shù)、自動(dòng)化設(shè)備、數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)、檢測(cè)試劑及生物信息學(xué)等方面的優(yōu)勢(shì)，在細(xì)胞或分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞信號(hào)發(fā)送、信號(hào)傳導(dǎo)、信號(hào)接收及相關(guān)一系列反應(yīng)的成像、分析及篩選，可以在短期內(nèi)識(shí)別大量基因、蛋白的作用。相較于傳統(tǒng)的細(xì)胞遷徙篩選方法如侵襲小室侵襲和劃痕愈合試驗(yàn)，HCS可直接在細(xì)胞芯片層面上對(duì)細(xì)胞行為進(jìn)行調(diào)查研究，從而篩選出一個(gè)與肝癌有關(guān)的基因庫，而且識(shí)別出涉及肝癌增殖、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為相關(guān)的基因：如LI等［19］近期采用高內(nèi)涵篩選證實(shí)了AEG?1和AKRIC2這兩個(gè)在肝癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵基因，從而為肝癌轉(zhuǎn)移的靶向治療研究提供了新的候選靶點(diǎn)。筆者最近也將高內(nèi)涵篩選技術(shù)應(yīng)用于肝癌潛在治療靶點(diǎn)Mus81基因的分子作用機(jī)制研究。筆者前期通過基因芯片得到了數(shù)百個(gè)與Mus81基因中可能相關(guān)的差異表達(dá)基因，接著通過生物信息學(xué)分析及高內(nèi)涵篩選，從這數(shù)百個(gè)差異基因中篩選出數(shù)個(gè)與肝癌增殖相關(guān)的基因，并最終鑒定得到了Mus81的關(guān)鍵下游基因——STC2［20］，從而為針對(duì)Mus81基因進(jìn)行肝癌靶向治療研究提供了新的理論依據(jù)。

4.3 其他 高內(nèi)涵篩選加快了腫瘤學(xué)行為機(jī)制研究的速度［21］。它既可鑒定誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長過程中有絲分裂停止的小分子，也可篩選出候選的腫瘤抑制基因［22］，為了解腫瘤細(xì)胞癌變前的生理機(jī)制及相關(guān)抑制機(jī)制提供重要依據(jù)。同時(shí)，借助多參數(shù)的高內(nèi)涵篩選平板、可視化數(shù)據(jù)和表型分類方法，可詳細(xì)地解釋個(gè)體復(fù)合效應(yīng)和大量收集到的多個(gè)參數(shù)的細(xì)胞反應(yīng)，從而為肝癌的靶向治療提供基礎(chǔ)。

綜上所述，HCS技術(shù)在分子機(jī)制研究中具有重要作用，其研究對(duì)象也已不再局限于小型生物分子，而是逐步擴(kuò)大到蛋白質(zhì)、小分子肽類等大分子。如分析Rab蛋白在高爾基前體退化的追蹤作用［23］、鑒定肝細(xì)胞內(nèi)控制脂肪小滴形成和生長的小分子核糖核酸等［24］。隨著HCS技術(shù)的飛速發(fā)展及人們對(duì)該技術(shù)的不斷改進(jìn)提高，如AMSBIO公司分析細(xì)胞侵襲的新型3D培養(yǎng)96孔基底膜提取板、Arte?mis公司的QS14熱電的冷卻CCD相機(jī)、Greiner Bio?One公司的96孔玻璃底微孔板等的開發(fā)［25］，因而可以想見，其在分子機(jī)制研究中的應(yīng)用也將愈加豐富多彩。

參考文獻(xiàn)

［1］LEDERMAN L.High?content screening［J］.Bio Techniques，2007，43（1）：25，27，29.

［2］XIA X，WONG S T.Concise review：a high?content screening approach to stem cell research and drug discovery［J］.Stem cells（Dayton，Ohio），2012，30（9）：1800?1807.

［3］趙金伴，喻希.化學(xué)技術(shù)的前沿——高內(nèi)涵篩選技術(shù)的研究及應(yīng)用［J］.化工技術(shù)與開發(fā)，2008，37（8）：19?22.

［4］ABRAHAM V C，TAYLOR D L，HASKINS J R.High content screening applied to large?scale cell biology［J］.Trends Bio?technol，2004，22（1）：15?22.

［5］KUMMEL A，SELZER P，BEIBEL M，et al.Comparison of multivariate data analysis strategies for high?content screening［J］.J Biomolecular Screening，2011，16（3）：338?347.

［6］LI S，BESSON S，BLACKBURN C，et al.Metadata manage?ment for high content screening in omero［J］.Methods，2016，96：27?32.

［7］ERFLE H，NEUMANN B，LIEBEL U，et al.Reverse transfec?tion on cell arrays for high content screening microscopy［J］.Nature Protocols，2007，2（2）：392?399.

［8］ESPOSITO A，DOHM C P，BAHR M，et al.Unsupervised flu?orescence lifetime imaging microscopy for high content and high throughput screening［J］.Mol Cell Proteomics，2007，6（8）：1446?1454.

［9］LEUCHOWIUS K J，JARVIUS M，WICKSTROM M，et al.High content screening for inhibitors of protein interactions and post?translational modifications in primary cells by proximity li?gation［J］.Mol Cell Proteomics，2010，9（1）：178?183.

［10］ BUCHHOLZ M，HONSTEIN T，KIRCHHOFF S，et al.A mul?tistep high?content screening approach to identify novel function?ally relevant target genes in pancreatic cancer［J］.PloS One，2015，10（4）：e0122946.

［11］ CHAROENKWAN P，HWANG E，CUTLER R W，et al.Hcs?neurons：Identifying phenotypic changes in multi?neuron imag?es upon drug treatments of high?content screening［J］.Bioinfor?matics，2013，14（16）：1-15.

［12］ REISEN F，ZHANG X，GABRIEL D，et al.Benchmarking of multivariate similarity measures for high?content screening fin?gerprints in phenotypic drug discovery［J］.J Biomol Screen，2013，18（10）：1284?1297.

［13］ ZOCK J M.Applications of high content screening in life sci?ence research［J］.Comb Chem High Throughput scree，2009，12（9）：870?876.

［14］ TORRE L A，BRAY F，SIEGEL R L，et al.Global cancer sta?tistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87?108.

［15］ YANG L Y，F(xiàn)ANG F，OU D P，et al.Solitary large hepatocel?lular carcinoma：a specific subtype of hepatocellular carcinoma with good outcome after hepatic resection［J］.Ann Surg，2009，249（1）：118?123.

［16］ PASCUAL S，HERRERA I，IRURZUN J.New advances in he?patocellular carcinoma［J］.World J Hepatol，2016，8（9）：421?438.

［17］ STOTZ M，GERGER A，HAYBAECK J，et al.Molecular tar?geted therapies in hepatocellular carcinoma：Past，present and future［J］.Anticancer Res，2015，35（11）：5737?5744.

［18］ THILLAI K，ROSS P，SARKER D.Molecularly targeted thera?py for advanced hepatocellular carcinoma?a drug development crisis？［J］.World J Gastrointestinal Oncol，2016，8（2）：173?185.

［19］ LI C，WU X，ZHANG W，et al.High?content functional screening of aeg?1 and akr1c2 for the promotion of metastasis in liver cancer［J］.J Biomol Screen，2016，21（1）：101?107.

［20］ WU F，LI T Y，SU S C，et al.Stc2 as a novel mediator for mus81?dependent proliferation and survival in hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Lett，2017，388：177?186.

［21］ TOWNE D L，NICHOLL E E，COMESS K M，et al.Develop?ment of a high?content screening assay panel to accelerate mech?anism of action studies for oncology research ［J］.J Biomol Screen，2012，17（8）：1005?1017.

［22］ LAHTELA J，CORSON L B，HEMMES A，et al.A high?con?tent cellular senescence screen identifies candidate tumor sup?pressors，including epha3［J］.Cell Cycle（Georgetown，Tex），2013，12（4）：625?634.

［23］ GALEA G，BEXIGA M G，PANARELLA A，et al.A high?con?tent screening microscopy approach to dissect the role of rab proteins in golgi?to?er retrograde trafficking［J］.J Cell Sci，2015，128（13）：2339?2349.

［24］ WHITTAKER R，LOY P A，SISMAN E，et al.Identification of micrornas that control lipid droplet formation and growth in hepatocytes via high?content screening［J］.J Biomole Screen，2010，15（7）：798?805.

［25］ MATTHEAKIS L.High?content screening：Imaging，analysis，and applications［J］.J Biomol Screen，2013，18（7）：845?847.