趙夢(mèng)迪，黎丹奇，陳笑南，喻剛艷，白 潔，李鵬躍，陸 洋，杜守穎

0 引言

將現(xiàn)代新型制劑技術(shù)用于傳統(tǒng)名方，是中藥現(xiàn)代化的一條重要途徑。復(fù)方丹參方是臨床治療冠心病的名優(yōu)處方。近年文獻(xiàn)報(bào)道，復(fù)方丹參制劑可引起不良反應(yīng)[1-3]。胃腸不良反應(yīng)是口服復(fù)方丹參制劑的常見不良反應(yīng)之一[4-5]，可能是因?yàn)榉街凶羰顾幈幮院疀?，久服可能傷胃。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，冰片大劑量或者長(zhǎng)期服用時(shí)會(huì)刺激胃黏膜，造成胃部不適[6]。本課題組前期用β-環(huán)糊精包合佐使藥冰片，采用現(xiàn)代技術(shù)，將名優(yōu)處方復(fù)方丹參方制成黏附微丸，增加藥物在胃腸道的停留時(shí)間，以期提高其生物利用度。但是，黏附微丸中的黏附材料在胃腸道停留時(shí)間較長(zhǎng)，也有可能造成黏膜刺激性，因此，本實(shí)驗(yàn)以冰片不包合的黏附微丸和普通復(fù)方丹參黏附微丸為參比，考察黏附材料是否會(huì)對(duì)黏膜產(chǎn)生刺激性以及復(fù)方丹參黏附微丸中冰片經(jīng)包合后，是否能降低對(duì)胃腸道的刺激。

1 材料

1.1 儀器與試劑 自制灌胃器，勻漿機(jī)(常州恒隆儀器有限公司)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海天美生化儀器設(shè)備有限公司)，Multiskan Go型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher)，96孔板(美國(guó)Corning Iocorporated)，手術(shù)剪及鑷子，OLYMPUS BX51型顯微鏡(日本)。普通復(fù)方丹參微丸，復(fù)方丹參冰片包合黏附微丸，復(fù)方丹參冰片不包合黏附微丸，空白黏附微丸(以上制劑均為實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：20160612)。純凈水(娃哈哈集團(tuán)有限公司)，PBS溶液(索萊寶)，氯化鈉(西隴化工股份有限公司，AR分析純)，LDH試劑盒(南京建成)，MDA試劑盒(碧云天)，脫氧膽酸鈉(索萊寶)。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)的SD雄性大鼠45只，體重240～260 g [北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001]。中華大蟾蜍36只，體重40～50 g (江蘇振興蟾業(yè))。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 體外實(shí)驗(yàn)[7]體外蟾蜍上顎纖毛毒性實(shí)驗(yàn)方法：取蟾蜍36只，隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組(KB)，陽性對(duì)照組(SD)，普通復(fù)方丹參制劑組(PT)，復(fù)方丹參冰片不包合黏附微丸組(NBNF)，復(fù)方丹參冰片包合黏附微丸組(BNF)，空白黏附微丸組(CL)，每組6只。除空白對(duì)照組和陽性對(duì)照組，其余組別給藥量為藥物粉末0.5 g/只。

將蟾蜍仰臥并固定于蛙板上，用止血鉗使其口腔張開，防止其閉合和吞咽。同時(shí)，將各組藥物分別用少量水潤(rùn)濕，空白對(duì)照組滴加0.5 g生理鹽水，陽性對(duì)照組滴加0.5 g的1%去氧膽酸鈉溶液，其余組別給藥量為相應(yīng)微丸粉末0.5 g/只。將藥粉平鋪于蟾蜍上顎，滴加適量水浸潤(rùn)藥物，給藥0.5 h后，用生理鹽水沖凈藥物。然后用眼科剪和眼科鑷分離上顎黏膜，取約大小5 mm×5 mm的黏膜，黏膜分離后立即用生理鹽水洗去血污及雜物。將取得的黏膜纖毛面向上平鋪于載玻片上，于黏膜表面滴加少量生理鹽水使之浸潤(rùn)，輕輕蓋上蓋玻片，于光學(xué)顯微鏡下觀察纖毛運(yùn)動(dòng)情況。每次觀察完畢，立即將黏膜置于預(yù)先用少量蒸餾水飽和的培養(yǎng)皿中，密閉，環(huán)境溫度為25 ℃。每隔適當(dāng)?shù)臅r(shí)間取出上顎標(biāo)本，于光學(xué)顯微鏡下觀察，如纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)，則放回培養(yǎng)皿中，直至纖毛停止運(yùn)動(dòng)。

記錄從開始給藥到纖毛停止運(yùn)動(dòng)的時(shí)間，即纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間(Persistent vibration duration，PVD)。通過比較PVD值，評(píng)價(jià)不同制劑對(duì)上顎纖毛的毒性，PVD越長(zhǎng)，表明毒性越小。

2.2 體內(nèi)方法 45只大鼠隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組(KB)，普通復(fù)方丹參微丸組(PT)，復(fù)方丹參冰片不包合黏附微丸組(NBNF)，復(fù)方丹參冰片包合黏附微丸組(BNF)，空白黏附微丸組(CL)，每組9只。各組大鼠均采用灌胃給藥，給藥量為2.4 g/(kg·d)。每組大鼠隨機(jī)平均分為3批，第1批給藥1周后立即處死，第2批給藥2周后立即處死，第3批給藥4周后立即處死。大鼠處死后觀察胃、腸黏膜變化，并對(duì)其胃、腸黏膜進(jìn)行病理切片觀察，以及MDA、LDH試劑盒檢測(cè)。

2.2.1 大鼠病理切片評(píng)價(jià) 分別于灌胃給藥后1、2、4周后脫頸椎處死大鼠，解剖獲取大鼠胃、腸黏膜，觀察胃、腸黏膜是否出血，是否有非正常分泌物、結(jié)構(gòu)層次是否清晰等，然后將大鼠胃、腸黏膜用10%的甲醛固定，經(jīng)取材、固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、貼片以及HE染色和封片操作制成胃、腸黏膜病理切片，光鏡下觀察胃黏膜的層次結(jié)構(gòu)、炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度等。

2.2.2 胃、腸黏膜氧化損傷及細(xì)胞毒性測(cè)試 各組大鼠于灌胃給藥2、4周后脫頸椎處死，解剖獲取10%胃、10%腸組織勻漿，按MDA、LDH試劑盒方法測(cè)定胃、腸組織中MDA含量和LDH含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 體外評(píng)價(jià)結(jié)果 各組在體蟾蜍上顎纖毛毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與KB組比較，PVD結(jié)果如圖1。在體蟾蜍上顎黏膜纖毛毒性觀察結(jié)果見圖2，KB組上顎纖毛清晰，完整，擺動(dòng)活躍；SD組觀察到蟾蜍纖毛不清晰，無運(yùn)動(dòng)狀態(tài)；CL組、BNF組、NBNF組、PT組均能觀察蟾蜍上顎纖毛清晰，擺動(dòng)活躍，如圖2。

通過對(duì)各組藥物對(duì)蟾蜍上顎黏膜纖毛運(yùn)動(dòng)時(shí)間影響的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，SD組PVD小于KB組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組PVD略小于空白對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，3種復(fù)方丹參黏附微丸組的PVD值雖略有變化，但各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明，本課題組制備的復(fù)方丹參黏附微丸中的黏附材料和各種復(fù)方丹參微丸對(duì)胃腸道無顯著刺激性。

3.2 體內(nèi)評(píng)價(jià)部分

3.2.1 病理切片及結(jié)果 脫頸椎處死大鼠后，解剖觀察大鼠胃、腸黏膜，各組大鼠胃、腸黏膜均無充血現(xiàn)象，沒有觀察到明顯的異常分泌物，顏色鮮亮粉嫩，未見纖維增生，未見泡狀細(xì)胞增生，而且層次結(jié)構(gòu)清晰。圖3～圖14分別為連續(xù)給藥1、2、4周后大鼠的胃、腸黏膜病理切片圖。

圖1 蟾蜍上顎纖毛運(yùn)動(dòng)時(shí)間(PVD)

圖2 各組給藥 30 min 后蟾蜍上顎纖毛結(jié)構(gòu)(400×)

圖3 連續(xù)給藥1周的胃黏膜病理切片圖(100×)

圖4 連續(xù)給藥1周的胃黏膜病理切片圖(400×)

圖5 連續(xù)給藥1周的腸黏膜病理切片圖(100×)

圖6 連續(xù)給藥1周的腸黏膜病理切片圖(400×)

圖7 連續(xù)給藥2周的胃黏膜病理切片圖(100×)

圖8 連續(xù)給藥2周的胃黏膜病理切片圖(400×)

圖9 連續(xù)給藥2周的腸黏膜病理切片圖(100×)

圖10 連續(xù)給藥2周的腸黏膜病理切片圖(400×)

圖11 連續(xù)給藥4周的胃黏膜病理切片圖(100×)

圖12 連續(xù)給藥4周的胃黏膜病理切片圖(400×)

圖13 連續(xù)給藥4周的腸黏膜病理切片圖(100×)

由顯微鏡(100×)可知，連續(xù)給藥1、2、4周后，與KB組比較，CL、NBNF、BNF、PT組大鼠胃、腸黏膜無明顯改變，結(jié)構(gòu)層次完整、清晰；由顯微鏡(400×)可知，連續(xù)給藥1、2、4周時(shí)，與KB組比較，CL、NBNF、BNF、PT組大鼠胃、腸黏膜均無明顯改變，未見纖維增生，也未見炎細(xì)胞浸潤(rùn)和泡狀細(xì)胞增生。結(jié)果表明，連續(xù)給藥1、2、4周后，黏附材料及復(fù)方丹參黏附均無明顯刺激性。

3.2.2 胃、腸組織氧化損傷及細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果 由表1、表2可見，連續(xù)給藥2、4周后，CL、NBNF、BNF、PT組胃腸的MDA、LDH濃度與KB組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明黏附材料并未對(duì)胃腸道造成顯著刺激，冰片包合/不包合復(fù)方丹參黏附微丸對(duì)胃腸道也無顯著刺激性。

4 討論

蟾蜍上顎纖毛毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，顯微鏡下空白黏附微丸、普通復(fù)方丹參微丸、復(fù)方丹參冰片包合黏附微丸、復(fù)方丹參冰片不包合黏附微丸組均能看到清晰纖毛，且擺動(dòng)活躍，PVD比較結(jié)果顯示，各微丸組PVD略低于空白對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。通過大鼠胃、腸黏膜肉眼觀察、病理切片、氧化損傷及細(xì)胞毒性測(cè)試實(shí)驗(yàn)，可發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)所考察的空白黏附微丸及3種復(fù)方丹參微丸均未改變大鼠胃、腸黏膜表面形態(tài)，未見纖維增生，也未見炎細(xì)胞浸潤(rùn)和泡狀細(xì)胞增生等病理變化。分析可能主要存在2個(gè)原因：①?gòu)?fù)方丹參制劑中的冰片含量不大，黏膜對(duì)此劑量不敏感，有報(bào)道，服用復(fù)方丹參制劑產(chǎn)生刺激性，可能是少數(shù)的個(gè)別體質(zhì)原因；②服用時(shí)間較短，本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠灌胃給藥1個(gè)月，低劑量冰片長(zhǎng)期服用可能會(huì)造成輕微刺激性，這有待進(jìn)一步考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方丹參黏附微丸中所用黏附材料及用量比例，對(duì)胃、腸黏膜沒有顯著刺激性，復(fù)方丹參冰片不包合黏附微丸及復(fù)方丹參冰片包合微丸對(duì)大鼠胃、腸道也無顯著刺激，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為復(fù)方丹參黏附微丸的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

表1 給藥后胃、腸組織MDA濃度(μmol/L)

表2 給藥后胃、腸組織LDH濃度(μmol/L)

刺激性評(píng)價(jià)多為外用制劑或鼻腔給藥劑型的重要評(píng)價(jià)內(nèi)容，口服制劑的胃腸道刺激性研究較少，本課題前期針對(duì)復(fù)方丹參制劑中冰片性寒，有可能存在黏膜刺激性的問題，采用β-環(huán)糊精冰片包合，一方面可以減少對(duì)人體的刺激性；另一方面又可以提高冰片在制劑中的穩(wěn)定性[8]。為了提高藥物的生物利用度，課題組在實(shí)驗(yàn)前期對(duì)不同黏附材料及用量進(jìn)行了考察，將復(fù)方丹參方制備成黏附微丸[9]，并對(duì)處方中冰片體外溶出行為進(jìn)行了對(duì)比研究[10]。

本研究結(jié)果表明，復(fù)方丹參黏附微丸中黏附材料及冰片包合前后制備的復(fù)方丹參黏附微丸對(duì)胃、腸黏膜無顯著性刺激，為復(fù)方丹參方新劑型的開發(fā)提供參考。

[1] 趙冉,古麗艷,王淳.1994-2014年復(fù)方丹參注射液不良反應(yīng)病案文獻(xiàn)分析[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2016,22(4):63-66.

[2] 李佰玲.復(fù)方丹參注射液不良反應(yīng)的回顧性研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào),2014,29(8):1184-1185.

[3] 劉林增.復(fù)方丹參滴丸的不良反應(yīng)與合理應(yīng)用效果評(píng)價(jià)[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2016,14(21):179-180.

[4] 李少春,馬麗娜,郝新梅,等.復(fù)方丹參滴丸不良反應(yīng)分析[J].中藥藥理與臨床,2016,32(1):171-174.

[5] 宋良斌,雷招寶,柳青.復(fù)方丹參滴丸的不良反應(yīng)與合理應(yīng)用[J].中成藥,2010,32(12):2157-2159.

[6] 胡利民,樊官偉,高秀梅,等.天然冰片、合成冰片對(duì)大鼠胃黏膜屏障影響的比較[J].天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,24(3):123-125.

[7] 程艷珂,郭懿望,尚可心,等.以溶解度與刺激性為指標(biāo)篩選葛根素滴鼻液溶劑及增溶劑[J].中國(guó)中藥雜志,2014,39(22):4335-4339.

[8] 郭麗蓉,周莉玲.冰片β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備及穩(wěn)定性[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(8):7-10.

[9] 趙壯,杜守穎,陸洋,等.卡波姆等6種生物黏附材料體內(nèi)外黏附性能評(píng)價(jià)[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2014,49(24):2188-2192.

[10]王振,杜守穎,陸洋,等.復(fù)方丹參腸黏附微丸中龍腦含量測(cè)定方法的建立及不同劑型龍腦溶出度的研究[J].中國(guó)中藥雜志,2015,40(16):3194-3199.