侯巧芝，吳建麗，張爽爽

(黃河科技學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，鄭州 450063)

原花青素(Procyanidins，簡稱PC)是一類黃烷醇單體及其聚合體形成的多酚類物質(zhì)，具有抗氧化、清除自由基等多種生理活性[1]。作為食品添加劑具有防腐、抗氧化等多重功效。甘蔗是我國制糖工業(yè)的主要原料之一，作為副產(chǎn)物的甘蔗皮含有大量的天然色素、蛋白質(zhì)和纖維等物質(zhì)，若能有效地開發(fā)利用能大大提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值[2]，同時(shí)有利于資源的循環(huán)利用。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)甘蔗皮中原花青素的提取工藝及性質(zhì)的研究鮮有報(bào)道[3]。本研究利用超聲輔助通過單因素考察和正交試驗(yàn)確定甘蔗皮的原花青素提取的最佳工藝，并考察原花青素粗提液的總抗氧化性能。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘蔗皮：鄭州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購買。

TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；XFB-200粉碎機(jī) 吉首市中誠制藥機(jī)械廠；7230G可見分光光度計(jì) 上海永光精密儀器有限公司；干燥箱、藥典篩、分析天平、托盤天平、超聲波清洗器、恒溫水浴鍋。

無水乙醇、濃鹽酸、香草醛粉末、丙酮、甲醇、原花青素標(biāo)準(zhǔn)品：以上試劑均為AR級(jí)，購于上海阿拉丁試劑網(wǎng)。

1.2 甘蔗皮原花青素的提取工藝

1.2.1 甘蔗皮原花青素主要提取流程

甘蔗皮清洗→烘干→粉碎→過篩→提取→粗濾液→測(cè)其吸光度。

1.2.2 溶劑的選擇

取1 g甘蔗皮粉末9份于9支錐形瓶中，分別加入純的甲醇、乙醇和丙酮10 mL各3份于錐形瓶中，再各自加入10 mL蒸餾水，在溫度50 ℃，浸泡時(shí)間30 min和超聲時(shí)間30 min后抽濾，各自加入相同量的香草醛-硫酸顯色劑于532 nm處測(cè)吸光度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙酮溶解性最好，乙醇次之，但考慮綠色化試驗(yàn)及實(shí)際的應(yīng)用，本試驗(yàn)選用乙醇作為溶劑。

1.2.3 波長的確定

取1 g甘蔗皮粉末于錐形瓶中，加入60%乙醇，超聲30 min，水浴鍋50 ℃加熱20 min后，抽濾，加入顯色劑在400～800 nm進(jìn)行波長掃描，在532 nm處有最大吸收，故本試驗(yàn)甘蔗皮中提取原花青素波長定為532 nm。

1.2.4 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品300 mg于50 mL容量瓶中用蒸餾水定容，超聲30 min后抽濾，再分別量取0，1.0，3.0，5.0，7.0，9.0 mL于10 mL容量瓶中用蒸餾水定容，加入顯色劑搖勻，在532 nm處測(cè)吸光度A，得到的線性回歸方程為 y=0.17742x+0.00293，R=0.9992，在濃度0.4～3.2 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.5 甘蔗皮中原花青素提取率的計(jì)算

提取率=C×V×n/m。

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出不同吸光度A所對(duì)應(yīng)的原花青素的濃度，mg/mL；V為測(cè)定提取液的原始體積，mL；n為稀釋的倍數(shù)；m為甘蔗皮粉末的質(zhì)量，g。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甘蔗皮中原花青素的提取

取1.0 g甘蔗皮粉末按料液比1∶30加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇水溶液30 mL，于50 ℃水浴鍋中浸泡30 min后超聲30 min。抽濾后加入顯色劑，于532 nm處測(cè)其吸光度，并計(jì)算提取率。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

在1.3.1項(xiàng)條件下進(jìn)行試驗(yàn)，保證其他條件相同的情況下改變其中的一個(gè)條件，分別考察料液比[1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 (g/mL)]、超聲時(shí)間(10，20，30，40，50，60 min)、溫度(10，20，30，40，50，60 ℃)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(0，30%，40%，50%，60%，70%)和浸泡時(shí)間(30，40，50，60，70，80 min)對(duì)提取率的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)選取料液比、超聲時(shí)間、溫度、浸泡時(shí)間為考察對(duì)象進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，見表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平Table 1 L9(34) orthogonal experimental factors and levels table

1.3.4 總抗氧化活性試驗(yàn)——FRAP法[4]

FRAP法基于Fe3+-三吡啶三吖嗪(trypyridyl-s-triazine，簡寫為TPTZ)螯合物在酸性環(huán)境下被還原為Fe2+-TPTZ螯合物后呈現(xiàn)明顯的藍(lán)色，該螯合物在593 nm處具有最大吸收。通過檢測(cè)藍(lán)色產(chǎn)物的生成量可反映待測(cè)原花青素樣品的還原能力。

1.3.4.1 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取FeSO4111.2 mg溶于水中，加入18 mol/L硫酸0.25 mL再加水稀釋至50 mL定容，并置入小鐵釘。取上述溶液5 mL于50 mL容量瓶中，定容至50 mL，即為800 μmol/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液。預(yù)先用小試管裝5 mL水，取5 mL FeSO4(800 μmol/L)標(biāo)準(zhǔn)溶液加入試管中，制得400 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，按此方法依次進(jìn)行，制得0，100，200，300，400，500，600，700，800 μmol/L的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液。取不同濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL，加入1.8 mL FRAP 工作液，混勻后于37 ℃反應(yīng)10 min，593 nm處測(cè)定吸光度，制定還原力標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2 總抗氧化能力測(cè)定

移取原花青素粗提液稀釋至不同濃度，準(zhǔn)確加入6 mL的FRAP，再加入600 μL的超純水混勻后置于37 ℃水浴鍋中放置10 min，于593 nm處測(cè)其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)提取率的影響

圖1 料液比對(duì)提取率的影響Fig.1 The effect of solid-liquid ratio on extraction yield

由圖1可知，提取率隨著料液比先增后減，料液比為1∶10，1∶20，1∶30時(shí)提取率較高，波動(dòng)較大；1∶40，1∶50對(duì)提取率影響不太明顯，所以選料液比為1∶10，1∶20，1∶30作為正交試驗(yàn)的條件。又因1∶10，1∶20需稀釋倍數(shù)較大，所以超聲時(shí)間、溫度等單因素試驗(yàn)均采用1∶30料液比作為條件。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on extraction yield

由圖2可知，超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，30 min提取率達(dá)最大，原因可能與超聲時(shí)間短原花青素溶出不完全，超聲時(shí)間長且在高溫的狀態(tài)下原花青素的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化有關(guān)[5]。據(jù)此，正交試驗(yàn)超聲時(shí)間選取20，30，40 min。

2.1.3 溫度對(duì)提取率的影響

圖3 溫度對(duì)提取率的影響Fig.3 The effect of temperature on extraction yield

由圖3可知，溫度對(duì)原花青素的提取率有較大的影響，溫度為50 ℃時(shí)為最佳提取工藝溫度，所以選取提取率相對(duì)較大的50，60，70 ℃作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響Fig.4 The effect of ethanol volume fraction on extraction yield

由圖4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素的提取率影響不是很大，整體幅度較平緩，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)提取率最大，所以本試驗(yàn)的乙醇體積分?jǐn)?shù)定為40%，乙醇體積分?jǐn)?shù)不作為正交試驗(yàn)的考察因素。

2.1.5 浸泡時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖5 浸泡時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.5 The effect of soaking time on extraction yield

由圖5可知，隨著浸泡時(shí)間的增加，提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，浸泡時(shí)間50 min時(shí)提取率達(dá)最大，原因可能與花青素的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。所以選取正交試驗(yàn)的3個(gè)水平為30，40，50 min。

2.2 正交試驗(yàn)

表2 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平結(jié)果Table 2 The results of L9(34) orthogonal experiment

由表2可知，各因素影響主次順序?yàn)椋毫弦罕?超聲時(shí)間>溫度>浸泡時(shí)間，最優(yōu)水平為A3B2C1D3，即料液比為1∶30 (g/mL)，超聲時(shí)間為30 min，溫度為50 ℃，浸泡時(shí)間為50 min。

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果，采用上述最佳工藝條件進(jìn)行甘蔗皮原花青素提取試驗(yàn)，即料液比1∶30 (g/mL)，超聲時(shí)間30 min，溫度50 ℃，浸泡時(shí)間50 min，乙醇的體積分?jǐn)?shù)40%，實(shí)際測(cè)得的提取率平均值為23.15 mg/g，RSD值為0.8%，與正交試驗(yàn)最佳結(jié)果基本相同。表明正交試驗(yàn)所得最佳工藝條件準(zhǔn)確可行。

2.4 抗氧化活性試驗(yàn)

2.4.1 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 The standard curve of FeSO4

由圖6可知，F(xiàn)eSO4濃度在 0.084～0.794 mmol/L范圍內(nèi)與吸光度A值線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=0.9732x+0.2328，相關(guān)系數(shù) R=0.9994。 因此以FRAP法在593 nm 處測(cè)定甘蔗皮中原花青素吸光度值，據(jù)此換算成FeSO4當(dāng)量濃度的方法是可行的。

2.4.2 總抗氧化能力測(cè)定

把測(cè)得不同濃度粗提液的吸光度值代入2.4.1項(xiàng)下FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成FeSO4當(dāng)量濃度，結(jié)果見圖7。

圖7 總抗氧化能力測(cè)定曲線Fig.7 Total antioxidant capacity measurement curve

由圖7可知，隨著甘蔗皮原花青素粗提液濃度的增加，其抗氧化活性增大，趨勢(shì)呈線性關(guān)系，線性相關(guān)方程為y=0.185x-0.2398，相關(guān)系數(shù)R=0.9991，擬合程度良好。

3 結(jié)語

本試驗(yàn)采用超聲輔助通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了原花青素提取的最佳工藝條件為料液比1∶30 (g/mL)，超聲時(shí)間30 min，溫度50 ℃，浸泡時(shí)間50 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，平均提取率為23.15 mg/g?？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明原花青素的抗氧化活性隨著濃度的增大呈線性增強(qiáng)。該研究為甘蔗皮中原花青素的進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。

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