劉翠翠，楊華，陳雄，姚娟，李志軍，李沛，李欣*

(1.湖北工業(yè)大學教育部發(fā)酵工程重點實驗室，工業(yè)微生物湖北省重點實驗室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068；2.湖北安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003)

酵母是現(xiàn)代生物產(chǎn)業(yè)中使用最廣泛的微生物，應用領域包括釀造發(fā)酵、飼料養(yǎng)殖、生物醫(yī)藥、營養(yǎng)健康等[1]。在重要的應用領域——醬油釀造過程中，魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)是主發(fā)酵酵母，是醬油釀造后期風味物質(zhì)的重要來源[2]。然而，魯氏酵母活性干酵母的應用受到極大的限制，主要是由于細胞本身耐性水平低導致其干酵母存活時間短。作為一種代謝合成的非還原性雙糖，海藻糖(Trehalose)賦予了細胞在高溫、脫水、冷凍、干燥等逆境環(huán)境下的抗逆能力[3-7]。同時，不同種屬和不同菌株的微生物的海藻糖合成能力及其抗性不同[8,9]。因此，對酵母細胞而言，分析特定菌株的性能對于該菌株的認識和應用評估等方面均有積極的意義[10]。本工作針對1株從民間傳統(tǒng)釀造食品中篩選出的生長能力強、耐鹽水平高、風味豐滿的魯氏酵母，研究了碳源、海藻糖合成和耐溫特性三者之間的關系，為進一步的應用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 酵母菌株及其培養(yǎng)

魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)CCTCC M2013310是1株從中國民間傳統(tǒng)釀造食品中篩選的酵母菌株，保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，簡稱 CCTCC)[11]。

酵母細胞培養(yǎng)基YEPD：10.00 g/L 酵母抽提物、20.00 g/L蛋白胨、20.00 g/L葡萄糖，pH 5.0。

酵母活細胞數(shù)檢測培養(yǎng)基為含1.5%瓊脂粉的固體YEPD培養(yǎng)基。

1.2 試劑

葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、蒽酮(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司；酵母粉、蛋白胨(生化試劑) 北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；糖蜜 安琪酵母股份有限公司；硫酸(優(yōu)級純) 信陽市化學試劑廠；瓊脂粉(分析純) 武漢市華順生物技術有限公司。

1.3 儀器設備

CJ-2D無菌操作臺 天津泰斯特儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；PL2002和AL104電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；BL-75A高壓滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司；HNY-211B恒溫搖床 天津歐諾儀器儀表有限公司；ZSD-A1160A恒溫培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；CT15RE離心機 日本日立公司；V-1100D可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；5804R型離心機 德國Eppendorf公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 培養(yǎng)基中碳源替換

將YEPD中的20.00 g/L葡萄糖按照等摩爾碳置換的原則替換成其他碳源。甘油、果糖和蔗糖在培養(yǎng)基中對應的濃度分別為20.45 mL/L，20.00 g/L和19.02 g/L。糖蜜以其主要成分蔗糖(37%)為置換對象，則對應濃度為51.41 mL/L。培養(yǎng)基中其他組分的濃度不變。

1.4.2 內(nèi)源性高海藻糖魯氏酵母的制備

在10 L發(fā)酵罐中，通過補料和控溫策略制備內(nèi)源性高海藻糖魯氏酵母[12]。在研究此酵母耐溫特性時，以上罐種子液中的魯氏酵母作為對照，即視為海藻糖未積累細胞。

1.4.3 高溫處理過程

魯氏酵母細胞培養(yǎng)或發(fā)酵后，2 mL細胞懸液被置于設定溫度的恒溫水浴鍋中，處理一定時間后，直接用于檢測酵母活細胞數(shù)。水浴溫度設定為35，40，45，50 ℃。

1.4.4 低溫處理過程

魯氏酵母細胞培養(yǎng)液、發(fā)酵液或發(fā)酵種子液被等分于2 mL滅菌離心管中，再分別放置于冰箱冷藏區(qū)(4 ℃)和冷凍區(qū)(-20 ℃)保存。每隔24 h取出1份樣品用于酵母活細胞數(shù)的檢測。

1.5 檢測方法

1.5.1 存活率和致死率的檢測

酵母活細胞數(shù)采用稀釋涂布法檢測。溫度處理樣品的魯氏酵母存活率和致死率用如下公式計算：

高溫酵母存活率(%)=

式(1)

低溫酵母存活率(%)=

式(2)

致死率(%)=1-存活率。

式(3)

1.5.2 胞內(nèi)海藻糖濃度的檢測

采用硫酸-蒽酮法測定胞內(nèi)海藻糖濃度[13]。取適量體積的新鮮酵母發(fā)酵液，用冰蒸餾水離心洗滌2次，在沉淀(酵母泥)中加入4 mL 0.5 mol/L三氯乙酸，將離心管震蕩混勻后置于冰塊中，并每15 min震蕩1次。1 h后于3000 r/min離心，其上清倒入50 mL容量瓶中。用冰水洗滌沉淀2次，其洗滌液均倒入容量瓶中，且最后用冰水定容。定容液被用于海藻糖濃度的測定。以含有4 mL 0.5 mol/L三氯乙酸的冰水為空白樣。

2 結果與分析

2.1 魯氏酵母高溫敏感性分析

細胞生長過程是一個生理動態(tài)變化過程，這意味著細胞對外界環(huán)境的響應特性也在變化。魯氏酵母CCTCC M2013310在YEPD營養(yǎng)條件下的不同生長期對高溫的敏感性見圖1。

圖1 YEPD中不同生長階段的魯氏酵母CCTCC M2013310對高溫(50 ℃，10 min)的敏感度Fig.1 The sensitivity of Z.rouxii CCTCC M2013310 to high temperature (50 ℃,10 min) at different growth stages of cell on YEPD medium

魯氏酵母CCTCC M2013310在適應末期或?qū)?shù)生長早期(7 h)比對數(shù)中期(14 h)和穩(wěn)定期初期(21 h)更耐熱，細胞存活率為4.00%，比對數(shù)中期和穩(wěn)定期分別提高4.49，4.39倍。可見，在這種簡單的營養(yǎng)環(huán)境下，魯氏酵母細胞在生長早期具有更好的抗高溫逆境的能力。然而，穩(wěn)定期的魯氏酵母細胞耐溫能力對酵母的保存保藏更為重要。穩(wěn)定期的魯氏酵母CCTCC M2013310的耐高溫特性見圖2。

圖2 YEPD中穩(wěn)定期的魯氏酵母CCTCC M2013310的耐高溫特性Fig.2 The properties of high temperature tolerance of Z.rouxii CTCC M2013310 harvested from the stationary phase on YEPD medium

整體上看，隨著處理溫度的上升和時間的延長，魯氏酵母細胞致死率也逐漸增大。穩(wěn)定期的魯氏酵母對不同溫度的敏感性顯示出差異。除45 ℃環(huán)境外，對數(shù)末期的魯氏酵母在處理早期對溫度更敏感。高溫維持2 min后，不同溫度下的致死率分別為71.54%(35 ℃)，81.43%(40 ℃)和88.17%(50 ℃)。繼續(xù)處理8 min后，酵母細胞致死率只分別增加了18.20%(35 ℃)，16.45%(40 ℃)和11.83%(50 ℃)。然而45 ℃下，4 min內(nèi)的酵母細胞致死率在所有溫度下都是最低的，分別為46.67%(2 min)和64.86%(4 min)。但最終處理10 min，其致死率也達到99.42%。

2.2 內(nèi)源性高海藻糖魯氏酵母耐高溫特性

海藻糖是一種普遍的酵母細胞逆境保護級，但對不同酵母的保護特性存在差異。通過發(fā)酵調(diào)控技術制備了海藻糖胞內(nèi)高積累水平(含量不低于8%)的魯氏酵母細胞懸液，以研究海藻糖對魯氏酵母CCTCC M2013310耐溫特性的影響。在40，50 ℃條件下分別處理5 min或10 min后的魯氏酵母CCTCC M2013310的活細胞存活率見圖3。

圖3 內(nèi)源性海藻糖積累對魯氏酵母CCTCC M2013310耐高溫特性影響Fig.3 The effect of high temperature on the capability of tolerant high temperature of Z.rouxii CTCC M2013310 accumulated endogenous trehalose

無論何種高溫和處理時間，海藻糖的積累都能顯著提高魯氏酵母的細胞存活率，特別是在40 ℃/10 min和50 ℃/5 min條件下。在這2種條件下，魯氏酵母CCTCC M2013310的細胞存活率分別從31.40%和49.73%恢復到100%，避免了熱損失。在最嚴重的逆境下(50 ℃，10 min)，細胞存活率也從1.36%提高到47.62%。可見，內(nèi)源性海藻糖的積累非常有利于魯氏酵母CCTCC M2013310在高溫逆境下生存。

2.3 內(nèi)源性高海藻糖魯氏酵母抗低溫特性

未積累與積累胞內(nèi)海藻糖的魯氏酵母CCTCC M

2013310在低溫(4 ℃)和冷凍逆境(-20 ℃)下的細胞存活率差異見圖4。

圖4 內(nèi)源性海藻糖對魯氏酵母CCTCC M2013310抗低溫(A)和冷凍能力(B)Fig.4 The effect of low temperature (A) and freezing(B) on the survival rate of Z.rouxii CTCC M2013310 accumulated endogenous trehalose

在15天的低溫保藏逆境下，胞內(nèi)未積累海藻的魯氏酵母CCTCC M2013310在保藏早期的細胞存活率略有下降，而后期的細胞存活率維持在89%水平。積累有高濃度海藻糖的魯氏酵母細胞在整個逆境周期下的細胞存活率不低于99%水平?？梢姡斒辖湍窩CTCC M2013310本身具有一定的耐低溫能力，而胞內(nèi)海藻糖的積累對該酵母的低溫耐受能力沒有顯著的效用。然而，在冷凍環(huán)境下，隨著冷凍時間的延長，胞內(nèi)未積累海藻糖的魯氏酵母細胞存活率顯著下降，到15天時，細胞存活率只有38.22%。然而，積累有胞內(nèi)海藻糖的魯氏酵母細胞存活率在冷凍周期內(nèi)依然很高，周期結束時的存活率高達85.87%，比對照提高了2.25倍?？梢姡麅?nèi)海藻糖的存在能顯著提高魯氏酵母CCTCC M2013310在冷凍逆境下的生存能力，這將有助于改善冷凍環(huán)境下的魯氏酵母細胞保藏水平。

2.4 不同碳源下魯氏酵母積累海藻糖和抗高溫能力的差異

6-磷酸葡萄糖既是海藻糖的前體物，也是海藻糖合成另一個前體物UDP-葡萄糖的前體[14]。由于6-磷酸葡萄糖位于糖酵解途徑，且是糖利用途徑的關鍵中間代謝產(chǎn)物，因此，不同碳源將對海藻糖合成產(chǎn)生影響。分別展現(xiàn)了酵母常用碳源葡萄糖和甘油、葡萄糖同系物果糖及雙糖蔗糖和糖蜜對魯氏酵母CCTCC M2013310積累海藻糖水平(A)和不同高溫環(huán)境下的生存差異(B)的影響，見圖5。

圖5 不同碳源對魯氏酵母CCTCC M2013310積累海藻糖(A)和耐高溫能力(B)的影響Fig.5 The effect of different carbon sources on the accumulated levels of endogenous trehalose (A) and the capability of tolerant high temperature (B) of Z.rouxii CCTCC M2013310

無論使用何種碳源為營養(yǎng)物，魯氏酵母胞內(nèi)海藻糖濃度都呈現(xiàn)隨著發(fā)酵時間的延長而增加且在穩(wěn)定期達到最大的特點。在穩(wěn)定期(26 h)，胞內(nèi)海藻糖的濃度分別為7.00 mg/g干重(甘油)、4.31 mg/g干重(葡萄糖)、6.88 mg/g干重(果糖)、5.78 mg/g干重(蔗糖)和4.86 mg/g干重(糖蜜)。不同于另外3種碳源，在生長前期(8 h)，以果糖和蔗糖為碳源時，胞內(nèi)海藻糖積累增加量不高。整體而言，果糖和甘油更利于胞內(nèi)海藻糖的合成，蔗糖和糖蜜次之，而葡萄糖的效果最差。值得注意的是，碳源對海藻糖積累的強弱效應差異并沒有與細胞耐高溫性能一一對應。以果糖為碳源所收獲的魯氏酵母抗高溫能力最強，無論是45 ℃還是50 ℃，其致死率分別為44.26%和57.35%。魯氏酵母在糖蜜或葡萄糖中生長后，其穩(wěn)定期細胞的抗逆水平最低，但表現(xiàn)出相近的耐高溫能力，致死率分別為67.36%，69.96%(45 ℃)和84.32%，80.87%(50 ℃)，比果糖條件下提高了24%～25%?？梢?，碳源對魯氏酵母合成海藻糖產(chǎn)生影響，且海藻糖積累水平高不一致細胞抗溫度逆境水平高，而海藻糖濃度低也并不意味細胞喪失耐溫能力。

3 結果與討論

魯氏酵母是一種重要的應用釀造酵母，對釀成產(chǎn)品風味的形成具有重要貢獻[15]。在釀造應用過程中，魯氏酵母面臨環(huán)境溫度的大幅度變化，因此，酵母的耐溫能力決定了魯氏酵母在釀造過程中功效發(fā)揮效果。魯氏酵母CCTCC M2013310是1株從民間傳統(tǒng)釀造食品中篩選出的酵母，具有生長能力強、耐鹽水平高、風味豐滿的特點。本研究分析了該酵母正常生長的耐溫特性及海藻糖對其抗溫逆境的能力，為該酵母的應用和研究提供了理論基礎和參考。

在簡單營養(yǎng)條件如YEPD下培養(yǎng)的魯氏酵母耐高溫水平低，但延遲期細胞卻有相對高的存活率。整體上，溫度越高，對魯氏酵母致死作用越大，處理10 min后的致死率基本達到100%。然而，增加魯氏酵母胞內(nèi)海藻糖濃度后，魯氏酵母細胞耐高溫能力顯著提高，但對細胞耐冷溫無明顯貢獻，卻有助于提高細胞耐冷凍水平。魯氏酵母細胞內(nèi)海藻糖積累與碳源有明顯關系。甘油和果糖能較好地促進魯氏酵母積累海藻糖，葡萄糖效果最差。而且，葡萄糖條件下的魯氏酵母細胞的耐熱能力很弱，遠低于果糖條件。

在研究結果中的一些問題需要說明和解釋。圖2所展現(xiàn)的魯氏酵母在45 ℃下的致死率曲線與其他溫度的差異既令人困惑，也很有趣。這種差異暗示45 ℃將給魯氏酵母細胞帶來新的、不同于其他溫度的生理狀態(tài)，而這種生理狀態(tài)賦予了酵母細胞擬定程度的短時耐溫能力。對魯氏酵母在該溫度下通過何種途徑獲得哪些生理變化還需要深入細致的研究。其二，圖3中出現(xiàn)的酵母細胞存活率高于100%的情況可能是由多種因素導致的，包括但不限于稀釋涂布人工操作導致的出芽孢子的分離、外源添加物的額外保護作用(如糖蜜)和系統(tǒng)誤差等。最需要解釋的碳源對魯氏酵母CCTCC M2013310細胞積累海藻糖水平和耐熱能力的差異(見圖5)。在釀酒酵母中，碳源的改變會導致碳代謝流、磷酸化作用和氧化還原中間物的變化[16，17]。一個合理的解釋是不同糖源具有不同中間代謝產(chǎn)物UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖積累特性，進而導致胞內(nèi)海藻糖合成水平的差異。這種差異反映到細胞耐溫能力上，但絕非全部。在釀酒酵母中，細胞的抗干燥能力雖然主要來源于胞內(nèi)海藻糖，但麥芽糖也承擔一定的功效?？梢?，魯氏酵母細胞的抗逆能力并非由單一的海藻糖濃度決定。

[1]田曉菊.酵母屬在食品工業(yè)中的應用[J].中國釀造,2015,34(4):13-16.

[2]趙麗云.天然醬醪中生香酵母的分離鑒定及其香氣特征分析[J].食品與機械,2012(4):11-14.

[3]Li H,Wang H L,Du J,et al.Trehalose protects wine yeast against oxidation under thermal stress[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2010,26(6):969-976.

[4]Hugo T,Lindsey Y,Douglas F,et al.Increasing intracellular trehalose is sufficient to confer desiccation tolerance toSaccharomycescerevisiae[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2015,112(19):6122-6127.

[5]Diniz-mendes L,Bernardes E,Araujo P S,et al.Preservation of frozen yeast cells by trehalose[J].Biotechnology and Bioengineering,1999,65(5):572-578.

[6]陳麗君,肖冬光,郭學武,等.面包酵母海藻糖含量與酵母耐性之間的關系[J].食品工業(yè)科技,2011(8):112，117.

[7]Toshihiko M.Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying[J].The British Journal of Ophthalmology,2001,85(5):610-612.

[8]Argüelles J C.Physiological roles of trehalose in bacteria and yeasts:a comparative analysis[J].Archives of Microbiology,2000,174(4):217-224.

[9]Solange I M,Ercilia M S M,Livia M C,et al.Sugars metabolism and ethanol production by different yeast strains from coffee industry wastes hydrolysates[J].Applied Energy,2012,92:763-768.

[10]Della-bianca B E,Gombert A K.Stress tolerance and growth physiology of yeast strains from the Brazilian fuel ethanol industry[J].Antonie Van Leeuwenhoek,2013,104(6):1083-1095.

[11]陳雄,代俊,王志.一種高耐鹽魯氏結合酵母[P].中國專利：ZL201310362802.2，2015-02-19.

[12]胡夢蝶.魯氏酵母積累海藻糖的發(fā)酵工藝研究[D].武漢:湖北工業(yè)大學,2016.

[13]胡夢蝶,陳雄,李欣,等.不同脅迫條件對魯氏酵母胞內(nèi)海藻糖積累的影響研究[J].食品工業(yè)科技,2016,37(11):130-133.

[14]池振明,梁麗琨,朱開玲,等.酵母海藻糖的代謝與調(diào)控研究進展[J].中國海洋大學學報(自然科學版),2006(2):209-214.

[15]衛(wèi)永華,齊威,王春玲,等.耐鹽酵母在醬油中的應用及其耐鹽機理的研究[J].中國釀造,2012(4):25-28.

[16]Sonia C,Juan C A,Miguel A A.Fluxes of carbon,phosphorylation,and redox intermediates during growth ofSaccharomycescerevisiaeon different carbon sources[J].Biotechnology and Bioengineering,1995,47:193-208.

[17]Verstrepen K J,Iserentant D,Malcorps P,et al.Glucose and sucrose:hazardous fast-food for industrial yeast？[J].Trends in Biotechnology,2004,22(10):531-537.