王蕓，位思清，王雪，宋榮珍，唐曉珍*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 泰安 271018；2.山東省外貿(mào)職業(yè)學(xué)院，山東 泰安 271000)

自由基是機(jī)體內(nèi)不可或缺的重要活性物質(zhì)，參與多種生命過程[1]。但是過多的自由基可以造成生物膜系統(tǒng)損傷以及細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化障礙[2,3]，引起慢性疾病及衰老效應(yīng)[4]，是人體疾病、衰老和死亡的直接參與者，對(duì)人體健康和壽命危害非常大。因此，尋找強(qiáng)有效的自由基清除劑已成為當(dāng)今十分活躍的研究領(lǐng)域[5-7]。

近年來，人們對(duì)多糖的抗氧化活性作用有了更深的認(rèn)識(shí)，已有大量研究表明：多糖類化合物具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過抗氧化作用、抑制亞油酸氧化等抗氧作用[8-10]。生姜多糖是生姜中的有效活性成分，具有很強(qiáng)的藥理作用，如抗疲勞、保護(hù)腦缺血再灌注損傷等[11，12]。部分研究發(fā)現(xiàn)與精多糖相比，粗多糖具有更高的活性[13]。因此，本文就不同方式提取所得的生姜粗、精多糖進(jìn)行抗氧化的研究，為生姜資源的開發(fā)和尋找有效的抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

生姜：山東大唐生物科技有限公司；纖維素酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶、S-8大孔樹脂：北京索萊寶科技有限公司；果膠酶：上海通善生物科技有限公司；無水乙醇、石油醚、磷酸氫二鈉、檸檬酸、葡萄糖、硫酸：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；蒽酮：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

FA2004 電子分析天平 上海上平儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；201A-1恒溫干燥箱 山東省龍口市電爐制造廠；RE52CS 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、B-220恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵、BT600-2J 蠕動(dòng)泵 保定蘭格恒流泵有限公司；1.6 cm×50 cm層析柱、HL-2S 恒流泵、SBS-100 數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 生姜多糖的不同方式提取

1.3.1.1 脫脂

鮮姜洗凈、去皮、切絲后，于55 ℃的烘箱中烘干12 h，索氏提取2次后[14]，揮干溶媒，得脫脂脫色姜粉。

1.3.1.2 酶法提取

將脫脂脫色的姜粉中加入1.5%纖維素酶、1%果膠酶、2%木瓜蛋白酶、2.5% α-淀粉酶，按料液比1∶20 (g/mL)添加pH為5.2磷酸-檸檬酸緩沖液，55 ℃水浴中浸提1 h。浸提結(jié)束后4500 r離心15 min。取上清液進(jìn)行抽濾，將抽濾液中加入3倍95%乙醇醇沉12 h，醇沉結(jié)束后取沉淀離心4500 r離心15 min。將沉淀復(fù)溶得生姜粗多糖溶液。水法提取[15]：將脫脂脫色后的姜粉按料液比1∶20(m/V)添加蒸餾水，90 ℃水浴3 h。后續(xù)操作同酶法提取。

1.3.1.3 超聲波輔助酶法提取[16]

將脫脂脫色的姜粉中加入1.5%纖維素酶、1%果膠酶、2%木瓜蛋白酶、2.5% α-淀粉酶，按料液比1∶20 (g/mL)添加pH為5.2的磷酸-檸檬酸緩沖液，55 ℃，400 W的條件下超聲20 min，之后水浴40 min。后續(xù)操作同酶法提取。

1.3.2 脫蛋白色素

將上述溶液配制成50 mg/mL的生姜粗多糖溶液分別進(jìn)行大孔樹脂純化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇純化條件為：上樣量70 mL；上樣濃度 50 mg/mL；上樣流速1.5 mL/min；用水洗脫，洗脫流速1.5 mL/min；洗脫體積2.5 BV。

1.3.3 透析

將脫蛋白后的生姜多糖溶液裝入孔徑為3500 kDa的透析袋中透析12 h，每隔4 h換1次水。

1.4 多糖含量測(cè)定

采用蒽酮比色法進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確吸取樣液1 mL加入具塞試管中，再加入5 mL蒽酮試劑，搖勻后立即放于沸水中水浴6 min。水浴結(jié)束后立即冷卻至室溫。以空白試劑為參比，于620 nm處測(cè)其吸光度[17]。

以葡萄糖濃度對(duì)吸光度y進(jìn)行線性回歸，線性回歸方程為y=5.197x，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，線性相關(guān)性良好。

1.5 多糖得率及純度計(jì)算

將上述多糖溶液冷凍干燥得固體樣品，稱重計(jì)算其得率和純度。

多糖得率[18]=粗多糖質(zhì)量/姜粉質(zhì)量×100%；

粗(精)多糖純度=粗(精)多糖樣品中多糖含量/粗(精)多糖樣品質(zhì)量×100%。

1.6 純度鑒定

將純化前、后的多糖溶液，用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行掃描。

1.7 抗氧化性測(cè)定[19]

1.7.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

分別取不同濃度的各樣品溶液2.0 mL，置于10 mL離心管中，加入3.0 mL的DPPH自由基溶液，然后室溫避光反應(yīng)30 min。以蒸餾水為空白，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。按下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

DPPH自由基清除率(%)=[A0-(As-Ac)]/A0×100%。

1.7.2 清除羥自由基活性的測(cè)定

分別取不同濃度生姜多糖溶液1.0 mL置于10 mL試管中，分別加入水楊酸-乙醇溶液1.0 mL，加蒸餾水至 5.0 mL，再分別加入H2O21.0 mL，于37 ℃水浴中反應(yīng)10 min。以蒸餾水為空白，于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。按照下列公式計(jì)算羥自由基清除率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

羥自由基清除率 (%)=[A0-(As-Ac)]/A0×100%。

1.7.3 還原力的測(cè)定

分別取不同濃度的各樣品溶液2.0 mL，分別加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液和2.5 mL鐵氰化鉀溶液，將所得的混合物于50 ℃水浴保溫20 min，然后加入2.5 mL三氯乙酸溶液，混合溶液4000 r/min離心10 min，精密吸取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL三氯化鐵溶液，以蒸餾水為空白，在700 nm處測(cè)吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5作圖，用SPSS 16.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±SD(n=3)表示，并進(jìn)行方差分析，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方式提取的生姜多糖主要化學(xué)組分的比較

表1 不同方式提取的生姜多糖得率和純度的比較Table 1 The yield and purity of ginger polysaccharides by different extraction ways

由表1可知，酶法提取的生姜粗多糖的得率和純度均明顯高于水法，但與超聲輔助酶法相比差異性不顯著(P<0.05)。超聲輔助酶法提取的生姜粗多糖的得率略高于酶法提取，這可能是由于果膠酶、纖維素酶和α-淀粉酶等酶類對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行破壁提取[20,21]，而后超聲波的機(jī)械破碎和空化作用促使了多糖和其他物質(zhì)從原料向溶劑的擴(kuò)散速率[22,23]，從而進(jìn)一步提高了其提取率。純化后的生姜精多糖基本不含蛋白質(zhì)、單糖、色素等物質(zhì)[24]。3種精多糖其純度均超過90%，差異性不顯著(P<0.05)。超聲輔助酶法提取生姜粗多糖純化后的純度略低于酶法和水法，這是由于超聲波輔助提取雖然可以提高多糖的提取得率，但會(huì)造成粗多糖的組分更加復(fù)雜，分離稍加困難[25]。

2.2 不同提取方式對(duì)生姜粗、精多糖抗氧化性的影響

2.2.1 對(duì)DPPH自由基清除率的影響

圖1 不同提取方式對(duì)生姜粗多糖DPPH自由基清除率的影響Fig.1 The effect of crude polysaccharides on DPPH radical scavenging activity by different extraction ways

DPPH自由基清除率是一種常用評(píng)價(jià)新抗氧化劑自由基清除率的方法[26,27]。由圖1可知，對(duì)于3種不同方式提取的生姜粗多糖，其DPPH自由基清除率均先隨生姜粗多糖濃度的增大而增大，當(dāng)濃度達(dá)到0.8 mg/mL后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，三者之間均差異性不顯著(P<0.05)。其清除率下降原因可能與生姜粗多糖的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，當(dāng)多糖溶液達(dá)到一定的濃度時(shí)，其有效基團(tuán)被包裹在內(nèi)無法外露產(chǎn)生作用[28]。結(jié)果表明不同方式提取的生姜粗多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力效果顯著，超聲輔助酶法、酶法和水法對(duì)DPPH自由基最高清除率依次為77.0%，75.4%和65.8%。

圖2 不同提取方式對(duì)生姜精多糖DPPH自由基清除率的影響Fig.2 The effect of pure polysaccharides on DPPH radical scavenging activity by different extraction ways

由圖2可知，在濃度為0～1 mg/mL的范圍內(nèi)，純化后的3種生姜精多糖其DPPH自由基清除率均隨濃度的增加而增大，并具有一定的線性關(guān)系。與粗多糖相比，3種精多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力較低，但在濃度為1 mg/mL時(shí)其對(duì)DPPH自由基清除能力基本等于粗多糖，超聲輔助酶法、酶法和水法對(duì)DPPH自由基的清除率依次為45.1%，44.1%和37.6%。此外，3種精多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力差異性不顯著(P<0.05)，說明純化后的多糖組分基本相同。上述說明粗多糖中對(duì)DPPH自由基發(fā)揮清除作用的成分是多糖。

2.2.2 對(duì)羥基自由基清除率的影響

圖3 不同提取方式對(duì)生姜粗多糖羥基自由基清除率的影響Fig.3 The effect of crude polysaccharides on hydroxy radical scavenging activity by different extraction ways

羥基自由基具有極高的反應(yīng)性能并可以損害細(xì)胞，但它可以被抗氧化劑抑制[29]。由圖3可知，對(duì)于不同方式提取的生姜粗多糖，都具有很高的羥自由基清除效果，清除效果差異性不顯著(P<0.05)，濃度在1 mg/mL時(shí)清除率分別高達(dá)99.7%，99.1%，93.1%。3種粗多糖對(duì)羥自由基的清除率隨濃度增大而增大，當(dāng)濃度高于0.2 mg/mL后三者都緩慢增大，差異性顯著(P<0.05)。結(jié)果表明不同方式提取生姜粗多糖對(duì)羥基自由基的清除能力效果顯著。

圖4 不同提取方式對(duì)生姜精多糖羥基自由基清除率的影響Fig.4 The effect of pure polysaccharides on hydroxy radical scavenging activity by different extraction ways

由圖4可知，與粗多糖相比，3種生姜精多糖對(duì)羥基自由基清除效果差異性不顯著(P<0.05)，在濃度為1 mg/mL時(shí)清除率僅為4.0%左右，這說明在實(shí)驗(yàn)條件下，生姜精多糖不與羥基自由基反應(yīng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)中所存的影響體系不大，故在510 nm波長(zhǎng)處吸收不明顯。結(jié)果表明生姜精多糖無清除羥基自由基的效果，粗多糖對(duì)羥基自由基的極其顯著清除效果不是精多糖的作用。

2.2.3 對(duì)還原力的影響

天然化合物還原能力可以作為評(píng)價(jià)羥自由基清除能力的一項(xiàng)重要指標(biāo)，還原能力越強(qiáng)，其羥自由基清除能力越強(qiáng)[30]。

圖5 不同提取方式對(duì)生姜粗多糖還原力的影響Fig.5 The effect of crude polysaccharides on reducing power by different extraction ways

由圖5可知，對(duì)于不同提取方式的生姜多糖其還原能力隨生姜多糖濃度的增大而增大，并具有一定的線性關(guān)系，其中超聲輔助酶法>酶法>水法。這表明不同方式提取的生姜多糖還原能力效果顯著，其中超聲輔助酶法提取的還原能力最強(qiáng)，在濃度為1 mg/mL時(shí)吸光度為1.38。

圖6 不同提取方式對(duì)生姜精多糖還原力的影響Fig.6 The effect of pure polysaccharides on reducing power by different extraction ways

由圖6可知，在還原力測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，與粗多糖相比，3種生姜精多糖的還原能力不顯著，在濃度為1 mg/mL時(shí)其吸光度僅為0.15左右，說明生姜精多糖不與反應(yīng)體系中的物質(zhì)反應(yīng)，在700 nm波長(zhǎng)處沒有吸收。

3 討論

在DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中，生姜粗、精多糖均具顯著的抗氧化性，說明粗多糖中的多糖發(fā)揮了清除DPPH自由基的作用。由于粗多糖中含有少量姜酚和姜黃酮等物質(zhì)，而姜酚和姜黃酮具有高的清除自由基的能力[31,32]，所以開始時(shí)羥基自由基清除生姜粗多糖的DPPH自由基清除能力高于精多糖。但當(dāng)生姜粗多糖溶液達(dá)到一定濃度后，其清除DPPH自由基的有效基團(tuán)被包埋在內(nèi)，無法外露產(chǎn)生作用，所以會(huì)出現(xiàn)下降現(xiàn)象。在羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)和還原力實(shí)驗(yàn)中，生姜粗多糖表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化性，而生姜精多糖的抗氧化性不顯著，說明粗多糖中發(fā)揮清除羥基自由基和還原能力的可能是除多糖外的其他成分，也可能是多糖與其他成分協(xié)同作用的結(jié)果[33]，但具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。與生姜粗多糖相比，精多糖的制備時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，制備工藝也相對(duì)復(fù)雜，這也對(duì)其抗氧化能力造成了一定的影響。另外，酶法提取的生姜多糖其得率、純度高，抗氧化性能高，從能源角度和工業(yè)成本可以考慮其為較佳的提取方式。

4 結(jié)論

經(jīng)超聲輔助酶法、酶法和水法3種方式提取生姜粗多糖和純化后生姜精多糖。結(jié)果表明3種不同方式提取的生姜粗多糖對(duì)DPPH自由基、羥基自由基的清除能力強(qiáng)，差異性不顯著(P<0.05)；還原能力與粗多糖的濃度具有線性關(guān)系，其中超聲輔助酶法>酶法>水法，差異性顯著(P<0.05)；而生姜精多糖只對(duì)DPPH自由基有顯著影響，對(duì)羥基自由基清除效果和還原能力不顯著。

[1]Valko M,Leibfritz D,Moncol J,et al.Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J].The International Journal of Biochemistry & Cell Biology,2007,39(1):44-84.

[2]趙虹，駱慶和，殷明，等.氧化應(yīng)激與阿爾茨海默病[J].中國(guó)老年學(xué)，2013，33(16):4090-4093.

[3]張翠利,付麗娜,楊小云,等.活性氧自由基與細(xì)胞衰老關(guān)系的研究進(jìn)展[J].廣州化工,2015(19):5-7.

[4]趙保路.自由基、營(yíng)養(yǎng)、天然抗氧化劑與衰老[J].生物物理學(xué)報(bào),2010(1):26-36.

[5]賈天華,崔紅.核桃楸皮的抗衰老自由基機(jī)制研究[J].中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué),2013(3):212-213.

[6]農(nóng)石生,龔子龍,周金花,等.板藍(lán)根抗氧化成分及抗氧化性能研究[J].中國(guó)野生植物資源,2017(3):18-22.

[7]鐘靈,王振富,文德鑒.黃芪多糖抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2013(4):350-352.

[8]陳玉琴,南海娟,劉坤峰.蕨菜多糖提取及抗氧化特性[J].北方園藝,2014(14):128-132.

[9]包瑛,馬岳,李雅雙,等.大白樁菇多糖的結(jié)構(gòu)鑒定及清除自由基活性[J].食品科學(xué),2016(6):71-76.

[10]段晉寧,肖旺,曾建紅,等.莪術(shù)多糖對(duì)糖尿病大鼠血糖、抗脂質(zhì)過氧化作用的影響與單糖組分分析[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2016(3):569-572.

[11]夏樹林,吳慶松.生姜多糖的提取及其抗疲勞作用[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014(4):240-242.

[12]宋琳琳,沙靖全,張磊,等.生姜粗多糖的提取及對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用[J].遼寧中醫(yī)雜志,2015(12):2433-2435.

[13]劉杭達(dá),馬千蘇,王傑,等.紫山藥粗多糖提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化性的研究[J].食品工業(yè)科技,2015(23):208-213.

[14]馬利華,秦衛(wèi)東,賀菊萍,等.復(fù)合酶法提取生姜多糖[J].食品科學(xué),2008(8):369-371.

[15]鄧勝國(guó),尹愛武,陳鐵壁.生姜多糖的提取工藝及其抗氧化活性研究[J].湖南科技學(xué)院學(xué)報(bào),2013(4):66-70，73.

[16]刁文超,王然,王鳳舞,等.超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取南瓜多糖工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué),2012(18):14-20.

[17]王憲澤,王保莉,馮炘.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理和方法[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2002:75-77.

[18]馮鑫,夏宇,陳貴堂,等.生姜皮多糖的分離純化及其結(jié)構(gòu)組成分析[J].食品科學(xué),2017(6):185-190.

[19]許海順,蔣劍平,徐攀,等.紅參多糖抗氧化活性的研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011(6):909-912.

[20]滕利榮,孟慶繁,劉培源.酶法提取百合多糖及其體外抗氧化活性[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版),2003,41(4):538-542.

[21]陳石良,孫震,谷文英.灰樹花深層發(fā)酵菌絲體多糖的酶法提取及其抗腫瘤作用[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào),2000，19(4):336-339.

[22]Zhang Y,Wang Z Y,Chen X Q.Ultrasound associated extraction of seed oil of Korean pine[J].Journal of Forestry Research,2005,16(2):140-142.

[23]趙玉紅,王靜,金秀明.超聲波輔助酶法提取榛子殼色素工藝條件的研究[J].中國(guó)調(diào)味品,2010,35(4):110-114.

[24]巴特.大棗多糖提取純化工藝研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)科技與裝備,2015(11):52-54.

[25]鄭德勇,安鑫南.植物抗氧化劑的研究概況與發(fā)展趨勢(shì)[J].林產(chǎn)化學(xué)業(yè),2004(3):113-118.

[26]Bondet V,Brand W,Berset C.Kinetics and mechanisms of antioxidant activity using the DPPH free radical method [J].Food Science and Technology,1997,30:609-615.

[27]Khaskheli S G,Zheng W,Sheikh S A,et al.Characterization ofAuriculariaauriculapolysaccharides and its antioxidant properties in fresh and pickled product[J].International Journal of Biological Macromolecules,2015,81:387-395.

[28]王金璽,顧林,孔凡偉,等.雞腿菇粗多糖的體外抗氧化性[J].食品科學(xué),2012(13):79-82.

[29]Rollet-Labelle E,Grange M J,Elbim C,et al.Hydroxyl radical as a potential intracellular mediator of polymorphonuclear neutrophil apoptosis[J].Free Radical Biology & Medicine,1998,24:563-572.

[30]Shimada K,Fujikawa K,Yahara K,et al.Antioxidative properties of xanthan on the autoxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion[J].Agric.Food Chem.,1992,40:945-948.

[31]馬建蘋.生姜中七個(gè)新的六氫姜黃素類化合物的NMR研究[A].中國(guó)物理學(xué)會(huì)波譜專業(yè)委員會(huì).第十三屆全國(guó)波譜學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C].中國(guó)物理學(xué)會(huì)波譜專業(yè)委員會(huì),2004:2.

[32]莫開菊,柳圣,程超.生姜黃酮的抗氧化活性研究[J].食品科學(xué),2006(9):110-115.

[33]娜日蘇.天然植物多糖及復(fù)合多糖的研究進(jìn)展[J].赤峰學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009(1):68-72.