李 鵬 ，汪中興 ，吳夢郡 ，余 魁 ，紀(jì)昌正 ，徐海旺 ，易 丹 ,2，王 蕾 ,2，趙 迪 ,2，侯永清 ,2*

（1.武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430023）

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分之一，進(jìn)入動物體內(nèi)會引發(fā)免疫應(yīng)激，導(dǎo)致大量自由基產(chǎn)生，造成腸道、肝臟等組織損傷。LPS刺激仔豬被認(rèn)為是模擬應(yīng)激的經(jīng)典模型[1]。近年來，由于抗生素濫用導(dǎo)致的耐藥菌及抗生素殘留問題對公共健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，開發(fā)抗生素替代品成為當(dāng)前動物營養(yǎng)學(xué)界的研究熱點。作為天然植物提取物，植物精油逐漸受到人們的青睞[2]。

肉桂油（Cimmmomum Oil）是樟樹科植物肉桂的干皮及樹皮經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油，其主要成分為肉桂醛，對細(xì)菌、酵母、霉菌的生長有較強的抑制作用[3]。牛至油（Origanum Oil）為牛至的提取物，其主要成分為香芹酚、百里酚等，可抑制和殺滅多種微生物[4]。百里香油（Thymus Oil）為百里香的提取物，其主要成分為百里香酚、香芹酚，被歐盟批準(zhǔn)為植保產(chǎn)品，具有抗菌和抗氧化等功效等[5-6]。肝臟是機體新陳代謝的主要場所之一，同時也是體內(nèi)的主要解毒和免疫防御器官。飼養(yǎng)環(huán)境中的致病性和非致病性抗原會刺激仔豬肝臟巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并釋放大量炎性介質(zhì)，進(jìn)而造成肝臟結(jié)構(gòu)和功能損傷[7]。因此，探究3種精油的復(fù)合物對仔豬肝臟在外界抗原刺激下的保護作用，對保證肝臟的健康、維持機體正常的新陳代謝至關(guān)重要。

本課題組前期研究表明，日糧中添加復(fù)合植物精油（OCT）可以降低仔豬腹瀉率，促進(jìn)仔豬生長[8]。本試驗通過建立仔豬LPS刺激模型，探究OCT對LPS刺激仔豬肝臟的保護作用，為開發(fā)綠色的添加劑產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計 選取 18頭體重為（7.34±0.62）kg的21日齡健康杜×長×大仔豬，隨機分為對照組、LPS組、OCT+LPS組，每個處理組6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。預(yù)試期4 d，正試期21 d。試驗期間，對照組與LPS組飼喂基礎(chǔ)日糧，OCT+LPS組在基礎(chǔ)日糧中添加50 mg/kg OCT，OCT由牛至油、肉桂油和百里香油按質(zhì)量比1:1:1混合配制而成。于試驗第21天，LPS組與OCT+LPS組仔豬腹腔注射LPS （100 μg/kg 體重），對照組注射等量的生理鹽水，3 h后前腔靜脈采血，6 h后屠宰取肝臟，待測。

1.2 試驗日糧與飼養(yǎng)管理 基礎(chǔ)日糧配制參照NRC（2012）豬的營養(yǎng)需要，基礎(chǔ)日糧的組成和營養(yǎng)成分見表1。豬舍為全封閉式，屋頂以排氣扇通風(fēng)，舍溫維持在25～27℃，料槽為可調(diào)式，鴨嘴式飲水器自動供水。進(jìn)欄前清洗豬舍并消毒。每籠1頭試驗豬，每天飼喂5次，豬舍定期清掃和消毒。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 血漿生化指標(biāo) 于試驗第21天注射LPS 后3 h，對每頭豬前腔靜脈采血，用2 mL的EDTA-Na抗凝真空采血管收集1.5 mL血液。將血樣于冰上靜置15 min，離心（3 000 r/min，10 min）分離血漿，采用日立7020全自動血漿生化分析儀，采用德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司的試劑盒測定谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、谷酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）。

1.3.2 肝臟組織抗氧化指標(biāo) 于試驗第21天注射LPS后6 h，對每頭豬進(jìn)行解剖取樣，取肝臟，置于冰上剪碎，采用錫箔紙包好放入紗布袋投入液氮中速凍，然后將肝臟樣品轉(zhuǎn)至盛有液氮的研缽中研磨成粉末，分裝。迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱凍存。將肝臟組織從-80℃冰箱中取出，稱取0.5 g左右，迅速置于預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入9倍體積的生理鹽水，在冰浴環(huán)境下勻漿，然后離心（4℃，3 000 r/min，15 min），取上清液。采用南京建成試劑盒檢測髓過氧化物酶（MPO）、一氧化氮合酶（T-NOS）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（i-NOS）。

1.3.2 肝臟相關(guān)基因mRNA水平的檢測 用RPL4基因做 內(nèi) 參， 檢 測HSP70、EGF、IL-10、IGF-1、mTOR基因的相對表達(dá)量，相關(guān)基因的引物序列見表2?？俁NA的提取和cDNA的合成均采用寶生物工程（大連）有限公司RNAiso Plus（Total RNA提取試劑）、PrimeScript?RT reagent kit with gDNA eraser（cDNA合成試劑盒）和SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（Real time PCR試劑盒）操作完成。參照Fu等[9]方法（2-△△CT法）統(tǒng)計分析各基因qPCR的數(shù)據(jù)結(jié)果。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 引物的設(shè)計合成 利用Primer premier 6.0軟件設(shè)計，由寶生物工程（大連）有限公司合成。各基因引物序列見表2。

1.5 統(tǒng)計分析 試驗采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan's多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。以P＜0.05表示差異顯著，以0.05＜P＜0.10表示具有顯著性趨勢。

表2 基因的引物序列表

2 結(jié) 果

2.1 OCT對LPS刺激仔豬血液生化指標(biāo)的影響 由表3可知，與對照組相比，LPS刺激顯著提高了仔豬血漿ALT、AST、ALP、GGT的活力（P＜0.05），而日糧中添加50 mg/kg的OCT可顯著緩解LPS導(dǎo)致的仔豬血漿ALT、AST、GGT活力的升高（P＜0.05）。

2.2 OCT對LPS刺激仔豬肝臟MPO、T-NOS和i-NOS含量的影響 由表4可知，與對照組相比，LPS刺激顯著提高了仔豬肝臟i-NOS的活力（P＜0.05），且有升高肝臟MPO活力的趨勢（P＜0.1）；日糧中添加50 mg/kg的OCT可緩解LPS導(dǎo)致的仔豬肝臟i-NOS活力的升高（P＜0.05），且有緩解LPS導(dǎo)致的仔豬肝臟MPO活力升高的趨勢（P＜0.1）。

2.3 肝臟相關(guān)基因mRNA水平 由表5可知，與對照組相比，LPS刺激顯著上調(diào)了仔豬肝臟HSP70基因的相對表達(dá)量（P＜0.05），下調(diào)了仔豬肝臟EGF、IL-10、IGF-1、mTOR基因的相對表達(dá)量（P＜0.05）。日糧中添加50 mg/kg的OCT可緩解LPS導(dǎo)致的仔豬肝臟HSP70基因相對表達(dá)量的升高以及EGF、IL-10、IGF-1、mTOR等基因相對表達(dá)量的降低（P＜0.05）。

3 討 論

功能完整的腸黏膜可對細(xì)菌和內(nèi)毒素構(gòu)成屏障作用，但是在LPS刺激后腸黏膜受損，大量細(xì)菌和毒素經(jīng)門靜脈和腸系膜淋巴系統(tǒng)，進(jìn)入人體血液循環(huán)引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，導(dǎo)致內(nèi)臟器官的損傷[10]。ALT和AST是血液常規(guī)檢測指標(biāo)之一，它們是蛋白質(zhì)代謝的重要酶類，也是常用的評價肝臟損傷的指標(biāo)。當(dāng)機體正常時，血液中ALT與AST含量很低，肝臟受損時，血液中的ALT與AST活性會顯著升高[11-12]。腸道疾病、自身免疫疾病及惡性腫瘤患者的ALP含量會顯著升高[13]，GGT是由肝細(xì)胞產(chǎn)生，并且在原發(fā)性肝癌患者體內(nèi)呈顯著性升高，是診斷原發(fā)性肝癌的重要腫瘤標(biāo)志物[14]。本試驗發(fā)現(xiàn)，OCT可以緩解LPS導(dǎo)致的仔豬血漿ALT、AST、ALP、GGT活力的升高，說明日糧中添加50 mg/kg的OCT可以緩解LPS對肝臟的損傷作用，從而對仔豬肝臟有保護作用，這與Wang等[15]研究結(jié)果一致。

表3 OCT對LPS刺激仔豬血液生化指標(biāo)的影響 U/L

表4 OCT對LPS刺激仔豬肝臟MPO、T-NOS和i-NOS含量的影響 U/mg prot

表5 OCT對LPS刺激仔豬肝臟相關(guān)基因mRNA水平的影響

MPO是一種含鐵溶酶體，其活性與中性粒細(xì)胞的功能是否正常以及激活有關(guān)，當(dāng)機體受到外界刺激或者疾病感染后，其含量會升高[16]。NOS分為T-NOS和i-NOS，NOS的作用主要是調(diào)控機體一氧化氮（NO）的水平。機體受到應(yīng)激后，i-NOS被活化，其含量顯著升高產(chǎn)生大量NO，高濃度的NO易結(jié)合O2-形成可誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化損傷的ONOO-[17]。本試驗發(fā)現(xiàn)，50 mg/kg的OCT可緩解LPS導(dǎo)致的仔豬肝臟i-NOS和MPO升高。研究表明，LPS刺激導(dǎo)致機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，可能是LPS刺激機體中性粒細(xì)胞發(fā)揮免疫功能，同時i-NOS被活化產(chǎn)生大量的NO，緩解機體氧化損傷[18]。OCT可以緩解LPS刺激造成的仔豬肝臟氧化損傷，有研究表明，肉桂油有抗氧化能力，可以降低潰瘍性損傷大鼠脂質(zhì)過氧化水平[19]；另有研究表明，肉桂油可以緩解LPS刺激導(dǎo)致的仔豬空腸GSH-Px的降低和過氧化氫（H2O2）的升高[15]。本研究還發(fā)現(xiàn)，日糧中添加OCT可以緩解LPS刺激引起的HSP70基因相對表達(dá)量的升高。HSP70通過其分子伴侶作用參與蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運、細(xì)胞保護、抗原呈遞及腫瘤免疫等許多生理活動過程；HSP70可以阻斷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的應(yīng)激酶（JNK）從而減少細(xì)胞凋亡表皮生長因子[20]。HSP70也是氧化應(yīng)激的標(biāo)志，LPS刺激會提高仔豬肝臟HSP70的表達(dá)[21]。Wang等[15]研究表明，肉桂油可以降低LPS刺激仔豬小腸HSP70的mRNA水平。以上研究進(jìn)一步說明了OCT可以通過降低LPS刺激造成的氧化應(yīng)激從而發(fā)揮對肝臟的保護作用，可能是復(fù)合植物精油中的肉桂油發(fā)揮主要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，OCT緩解了LPS刺激導(dǎo)致的仔豬肝臟EGF、IL-10、IGF-1和mTOR基因相對表達(dá)的降低，說明日糧中添加OCT可以降低LPS刺激引起的炎癥反應(yīng)，提高仔豬肝臟細(xì)胞的生長和增殖。EGF主要生理活性是誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分裂分化，促進(jìn)細(xì)胞生長[22]。EGF是一個龐大的族群，這個族群都是一些功能性小分子，它們通過與受體結(jié)合，打開細(xì)胞內(nèi)的Ras信號通路，從而促成DNA合成并刺激細(xì)胞的增殖[23]。IL-10是抗炎因子，可抑制T細(xì)胞的活化、刺激B細(xì)胞的增殖，會阻斷炎性介質(zhì)NO和H2O2的產(chǎn)生[24]。IGF對肌肉有很強的合成代謝效應(yīng)，能抑制蛋白質(zhì)的分解，提高氨基酸的攝取和細(xì)胞增生，是合成代謝的直接效應(yīng)物質(zhì)，當(dāng)機體肝臟功能受損時，IGF-1分泌顯著降低。IGF對動物胚胎以及出生后的生長、發(fā)育有重要作用[25]。mTOR在感受營養(yǎng)信號、調(diào)節(jié)細(xì)胞增長與增殖中起關(guān)鍵作用，可以加快細(xì)胞的生長與增殖[26]。LPS刺激使肝臟處于一種炎癥狀態(tài)，炎性因子分泌增加，此外，LPS刺激后IGF-1分泌顯著降低，而IGF-1位于mTOR信號通路上游，LPS刺激下調(diào)mTOR及EGF基因的表達(dá)，說明LPS也可能影響了肝細(xì)胞的增殖與分化，加快了蛋白的分解，抑制了細(xì)胞生長相關(guān)的信號通路，如mTOR和EGF等信號通路。而日糧中添加50 mg/kg的OCT緩解了LPS刺激造成的仔豬肝臟EGF、IL-10、IGF-1、mTOR基因相對表達(dá)量的降低，表明OCT對仔豬肝臟有保護作用可能與調(diào)控肝臟炎性基因的表達(dá)、mTOR和EGF信號通路有關(guān)。

4 結(jié) 論

LPS刺激使肝臟處于炎癥應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致肝臟損傷，日糧中添加50 mg/kg的OCT可緩解LPS刺激導(dǎo)致的仔豬肝臟損傷，這可能與mTOR和EGF信號通路有關(guān)?；诖搜芯浚磥砜梢詫TOR和EGF信號通路進(jìn)行更深入的探究，為飼料中天然植物精油的使用提供更可靠的理論基礎(chǔ)。

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