劉雪芹，游小燕，吳 夢(mèng)，丁玉春，劉作華*，葛良鵬*

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460；3.養(yǎng)豬科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460）

豬體細(xì)胞克隆技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于商業(yè)以及胚胎研究，其過(guò)程包括豬卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)、卵母細(xì)胞核移植、重構(gòu)胚融合、胚胎體外發(fā)育與胚胎移植，最后得到遺傳上與核供體細(xì)胞一致的后代。豬的體細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)全年都可以開(kāi)展，但一年四季氣候不同，大氣溫度也不相同，而豬的卵母細(xì)胞和胚胎對(duì)溫度變化非常敏感[1]，因此選擇合適的季節(jié)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)將有利于提高豬體細(xì)胞克隆效率。重慶素有“火爐”之稱，夏季高溫炎熱，且夏季是重慶全年最長(zhǎng)的季節(jié)，達(dá)120～140 d[2]。張坤等[3]研究表明，季節(jié)變化影響體外成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育能力，對(duì)胚胎移植的妊娠率和出生率都有影響。目前尚未出現(xiàn)關(guān)于重慶地區(qū)季節(jié)變化對(duì)體細(xì)胞克隆豬生產(chǎn)效率的影響的報(bào)道。本文統(tǒng)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)室2014—2016年不同季節(jié)的豬卵巢獲卵數(shù)、豬卵母細(xì)胞體外成熟率以及體細(xì)胞克隆代孕母豬妊娠率、產(chǎn)仔率，研究重慶地區(qū)不同月份對(duì)豬體細(xì)胞克隆的影響，找到適合開(kāi)展豬體細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)的月份，為提高豬體細(xì)胞克隆效率奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 由于本實(shí)驗(yàn)室在12—2月開(kāi)展實(shí)驗(yàn)較少，故實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不包括這幾個(gè)月。實(shí)驗(yàn)在重慶市榮昌縣進(jìn)行，夏季是重慶全年最長(zhǎng)的季節(jié)，參考《重慶統(tǒng)計(jì)年鑒2016》將月份大致劃分為3—5月（春季）、6—9月（夏季）、10—11月（秋季）。實(shí)驗(yàn)一比較3—5月、6—9月、10—11月豬卵母細(xì)胞的回收率以及體外培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞成熟率（排出第一極體卵母細(xì)胞比率），實(shí)驗(yàn)二比較在3—5月、6—9月、10—11月進(jìn)行胚胎移植手術(shù)對(duì)代孕母豬妊娠率和產(chǎn)仔率的影響。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 如無(wú)特殊注明，實(shí)驗(yàn)試劑均購(gòu)自Sigma公司，實(shí)驗(yàn)所用卵巢采自重慶市榮昌縣屠宰場(chǎng)。各種溶液配制參照《piPSC克隆豬研究》[4]。

洗卵液（PVA-TL -Hepes）：6.663 g NaCl，0.237 g KCl，0.168 g NaHCO3，0.041 g NaH2PO4，1.868 mL C3H5NaO3，0.102 g MgCl2·6H2O，2.383 g Hepes，0.065 g Penicillin G，0.010 g Phenol Red，0.294 g CaCl2·2H2O，0.100 g PVA，2.186 g Sorbitolum，0.025 g Gentamicin，0.022 g Sodium Pyruvate上述溶解于Mini-Q H2O中，調(diào)pH為7.2～7.4后用Mini-Q H2O定容至l 000 mL，0.22 μm濾器過(guò)濾分裝，放于4℃保存，3周內(nèi)用完。

成熟培養(yǎng)基：9.5 g/L TCM-199，1 g/L PVA，2.2 g/L NaHCO3，0.549 6 g/L D-Glucose，0.000 1 g/mL Sodium Pyruvate，0.075 g/L Penicillin G，0.05 g/L Streptomycin，0.07 g/L L-cysteine，0.5 μg/mL LH，0.5 μg/mL FSH，10 ng/mL EGF上述成分用胚胎用水定容，用0.22 μm濾器過(guò)濾分裝，放于4℃保存。

豬卵泡液（PFF）的獲?。撼槿?～6 mm卵泡中的液體到50 mL離心管中等卵沉到底部后抽取上層液體，1 000 r/min離心20 min后用0.45 μm濾膜過(guò)濾，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

去卵丘液：0.1 g Hyaluronidase，6 g Mannitol，0.001 g BSA，5 mL PVA-TL-Hepes，加胚胎用水溶解，溶解后用HCl調(diào)節(jié)pH到7.0～7.4，定容至100 mL，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，-20℃凍存。

操作液：0.95 g TCM-199，0.005 g NaHCO3，0.075 g Hepes，500 μL100×Penicillin G+ Streptomycin，0.175 5 g NaCl，0.3 g BSA加胚胎用水溶解定容至100 mL，用0.22 μm濾器過(guò)濾，放于4℃保存，2周內(nèi)用完。

融 合 液：2.73 g Mannitol，0.015 g CaCl2·2H2O，0.002 g MgCl2·6H2O，0.013 g Hepes加胚胎用水溶解定容至100 mL，用0.22 μm濾器過(guò)濾，放于4℃保存，2周內(nèi)用完。

豬胚胎培養(yǎng)基礎(chǔ)液（PZM-3）：0.6312 g NaCl，0.210 6 g NaHCO3，0.074 6 g KCl，0.004 8 g KH2PO4，0.009 8 g MgSO4·7H2O，0.061 6 g Ca-lactate·5H2O，0.002 2 g Sodium pyruvate，0.014 6 g L-glutamine，0.054 6 g Hypotaurine，2 mLBME，1 mL MEM，1 mL 100×Penicillin G+ Streptomycin，1%BSA 加胚胎用水溶解定容至100 mL，用0.22 μm濾器過(guò)濾分裝，放于4℃保存，2周內(nèi)用完。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)方法參照《piPSC克隆豬研究》[4]。

1.3.1 卵母細(xì)胞體外成熟 用裝有含青鏈霉素的38.5℃生理鹽水的保溫瓶在屠宰場(chǎng)取卵巢，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用20 mL的注射器扎破卵巢表面卵泡，同時(shí)抽出卵泡內(nèi)的液體（帶有卵母細(xì)胞復(fù)合物）。在體式顯微鏡下，用口吸管分別挑選卵丘包裹3層以上、致密而且胞質(zhì)均勻的卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs），用成熟培養(yǎng)液洗滌3遍再轉(zhuǎn)入在培養(yǎng)箱中至少己經(jīng)平衡4 h的培養(yǎng)液內(nèi)（每個(gè)培養(yǎng)孔500 μL培養(yǎng)液，放50～80個(gè)）。在38.5℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42～46 h。在成熟培養(yǎng)終止后，將COCs轉(zhuǎn)移到含1 mg/mL透明質(zhì)酸酶脫卵丘液中，用100 μL移液器吹打2～5 min脫去卵丘細(xì)胞。在體視鏡下挑選卵黃膜完整、卵周隙清楚、排出第一極體的視為成熟卵母細(xì)胞。

1.3.2 體細(xì)胞核移植顯微操作 采用盲吸法。在培養(yǎng)皿皿蓋中，用含CB濃度為7.5 ng/μL的操作液做幾個(gè)操作滴，中央1個(gè)滴放供核細(xì)胞，四周幾個(gè)滴放豬成熟卵母細(xì)胞，然后用礦物油覆蓋。將注射針（內(nèi)徑18～25 μm）和固定針（內(nèi)徑 10～20 μm，外徑 100～120 μm）裝上顯微操作臂，并調(diào)整好位置，調(diào)整好的注射針和固定針在一條直線上。固定針固定卵母細(xì)胞，注射針撥動(dòng)卵母細(xì)胞找到第一極體并吸取第一極體及其周?chē)?0%～20%可能含有卵母細(xì)胞核的胞質(zhì)。挑選直徑15～20 μm、邊緣光滑且折光性強(qiáng)的體細(xì)胞，并將其注入到卵周隙，點(diǎn)壓透明帶使供核細(xì)胞與受體卵的胞膜緊密接觸。操作完成后的卵母細(xì)胞是由供核細(xì)胞卵胞質(zhì)構(gòu)成的重構(gòu)卵，將重構(gòu)卵轉(zhuǎn)移到操作液中恢復(fù)。

1.3.3 重構(gòu)胚的融合與培養(yǎng) 將恢復(fù)好的重構(gòu)卵分批轉(zhuǎn)移到融合液中平衡20 s，洗滌3遍后，每批30個(gè)放入己經(jīng)鋪滿融合液的融合槽內(nèi)（電極寬度為500 μm，德國(guó) eppendorf），使供體細(xì)胞-受體卵細(xì)胞膜接觸面與電極平行，用融合儀進(jìn)行融合激活，參數(shù)為30 μs，55 V，2次脈沖，再用PZM-3洗滌5遍，立即轉(zhuǎn)入操作液中30 min后取出，在體視顯微鏡下判定是否融合。將融合胚胎在PZM-3中洗3遍后，轉(zhuǎn)入石蠟油覆蓋并預(yù)先在CO2培養(yǎng)箱中平衡至少2 h的PZM-3培養(yǎng)12～24 h。

1.3.4 胚胎移植及產(chǎn)仔率統(tǒng)計(jì) 以發(fā)情后2 d左右的太湖豬作為代孕母豬，將培養(yǎng)了12～24 h的重構(gòu)胚胎通過(guò)輸卵管傘部進(jìn)入輸卵管進(jìn)行胚胎移植。手術(shù)后的母豬單獨(dú)圈養(yǎng)，定期觀察以防傷口感染。觀察母豬返情情況，40 d后用全數(shù)字便攜式超聲診斷系統(tǒng)檢測(cè)妊娠情況，114 d左右根據(jù)產(chǎn)仔情況統(tǒng)計(jì)產(chǎn)仔率。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件中的t檢驗(yàn)和方差分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±變異系數(shù)表示。以P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同月份對(duì)豬卵巢回收卵母細(xì)胞數(shù)的影響 由表1所示，3—5月平均每個(gè)卵巢回收可用卵數(shù)顯著高于6—9月和 10—11月（P＜0.05），而6—9月和10—11月差異不顯著（P＞0.05）。

表1 不同月份對(duì)豬卵巢回收卵母細(xì)胞數(shù)的影響

2.2 不同月份對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響 由表 2可見(jiàn)，3—5月的卵母細(xì)胞體外成熟率顯著高于其他2組（P＜0.05），而6—9月和10—11月差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同月份對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響

2.3 不同月份對(duì)體細(xì)胞克隆代孕母豬妊娠率和產(chǎn)仔率的影響 由表3可見(jiàn)，3—5月進(jìn)行移植手術(shù)的代孕母豬的妊娠率（64.71%）高于6—9月（53.33%）和10—11月（53.33%）。3—5月的產(chǎn)仔率（52.94%）高于6—9月（20%）和10—11月（40%），6—9月進(jìn)行胚胎移植的代孕母豬的產(chǎn)仔率最低。

3 討 論

雖然研究者們已經(jīng)為改善豬體細(xì)胞克隆效率做出了很多的努力，但體外培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞的發(fā)育能力遠(yuǎn)未達(dá)到體內(nèi)發(fā)育水平。影響豬體細(xì)胞克隆生產(chǎn)的因素有很多，其中季節(jié)導(dǎo)致的溫度變化也是重要的因素之一。

本實(shí)驗(yàn)中，采集卵巢的生理鹽水溫度穩(wěn)定在38.5℃左右，并且在相同的溫度條件下培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，豬卵巢的回收卵母細(xì)胞數(shù)以及豬卵母細(xì)胞的成熟率的月度差異最有可能是由于大氣溫度變化所致。在重慶地區(qū)的3—11月，其中3—5月豬卵巢獲卵數(shù)最高，豬卵母細(xì)胞的體外成熟率也最高，表明季節(jié)是決定豬卵母細(xì)胞體外成熟率的主要因素之一；6—9月豬卵巢卵母細(xì)胞回收數(shù)少，體外成熟率低，可能與熱應(yīng)激有關(guān)。Hale等[5]報(bào)道，熱應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)卵泡期卵巢產(chǎn)生自噬，會(huì)增加卵母細(xì)胞和早期卵泡中的抗凋亡信號(hào)傳導(dǎo)。李莉等[6]報(bào)道，采集豬卵巢最適宜的月份為5—10月，其他季節(jié)采集的豬卵巢卵母細(xì)胞體外成熟率與這一季節(jié)相比差異顯著，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，這可能由于所處地區(qū)、氣候環(huán)境各異造成。

表3 不同胚胎移植月份對(duì)體細(xì)胞克隆代孕母豬產(chǎn)仔率的影響

產(chǎn)仔率是體細(xì)胞克隆效率最直觀的表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)中6—9月的豬卵巢獲卵數(shù)以及豬卵母細(xì)胞成熟率同10—11月沒(méi)有區(qū)別，但在后續(xù)的代孕母豬產(chǎn)仔率上，6—9月移植的代孕母豬其產(chǎn)仔率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于3—5月和10—11月。本實(shí)驗(yàn)在重慶市榮昌縣進(jìn)行，重慶大部分地區(qū)的極端高溫在40～43℃，而母豬最佳繁殖性能的溫度為18～20℃，22℃以上就會(huì)發(fā)生熱應(yīng)激。袁焰平等[7]報(bào)道，配種月份的平均溫度與母豬的平均產(chǎn)仔數(shù)、平均產(chǎn)活仔數(shù)均存在一定的負(fù)相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，6—9月進(jìn)行胚胎移植的代孕母豬的產(chǎn)仔率最低，說(shuō)明高溫天氣對(duì)胚胎移植的代孕母豬的產(chǎn)仔率有一定負(fù)面影響。

4 結(jié) 論

重慶地區(qū)不同月份的氣候條件對(duì)豬的卵巢獲卵數(shù)、豬卵母細(xì)胞成熟率以及代孕母豬產(chǎn)仔率都有影響，即對(duì)體細(xì)胞克隆豬的生產(chǎn)效率有影響。3—5月豬卵母細(xì)胞成熟率以及代孕母豬妊娠率、產(chǎn)仔率都最高，即3—5月體細(xì)胞克隆豬的生產(chǎn)效率最高，最適合做體細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)，其次為10—11月。

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