王立文，余 雄，趙艷坤，李 楊，邵 偉

（新疆農業(yè)大學動物科學學院，新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)實驗室，新疆烏魯木齊 830052）

本課題組研究發(fā)現(xiàn)，將間充質干細胞應用到畜牧生產(chǎn)能夠顯著促進動物體的生長發(fā)育，提高機體免疫能力[1]，可修復乳腺炎模型大鼠的乳腺組織，促進乳腺組織形態(tài)發(fā)育[2]，具有非常重要的作用。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信號通路是機體內一條重要的信號通路，參與多種細胞生物學過程，包括轉錄、翻譯、代謝、血管生成、細胞周期以及細胞增殖、凋亡等，由于具有多種生物學作用，已經(jīng)被應用到生理學、細胞學、臨床醫(yī)學、生物化學、組織遺傳學等方面并取得了一定的進展[3]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR信號通路是調節(jié)細胞增殖、分化和調亡的重要信號轉導通路。AKT可調控多個與細胞凋亡有關的家族從而抑制細胞凋亡[4]，例如可抑制Forkhead家族轉錄因子的活性，下調Fas/FasL誘導的凋亡過程；抑制前凋亡蛋白BAD及caspase-9的活性，阻止其促凋亡作用[5]。間充質干細胞能夠通過自分泌和旁分泌作用分泌一些細胞因子，作用于一些相關的受體，可將質膜上PIP2磷酸化為PIP3，從而激活PI3K/Akt/mTOR信號通路[6]。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1等生長因子可激活 PI3K/Akt信號，下游效應蛋白mTORC1 / S6K1 能促進成骨細胞分化[7]，并抑制其凋亡[8]。

目前認為PI3K/Akt/mTOR信號通路的上游刺激因子主要有4類，即生長因子與胰島素、營養(yǎng)因子、能量以及壓力[9]。眾所周知，臍帶間充質干細胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，UC-MSCs）可以分泌多種細胞活性因子，這些因子可以激活相關信號通路參與細胞生活動的調控。本研究首次利用UC-MSCs獨特的生物學特性，研究是否可以通過PI3K/Akt/mTOR信號通路調控乳腺上皮細胞（Bovine Mammary Gland Epithelial Cells，BMECs）的凋亡，為在細胞和分子水平上尋求泌乳生物學與乳腺功能調控的新方法、新途徑奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞來源 奶牛UC-MSCs來自于本實驗室培養(yǎng)鑒定的荷斯坦奶牛[10]，奶牛BMECs購自于廣州吉尼歐公司（MEC，GZ/JNO-2015）。

1.1.2 主要儀器和試劑 臺式低速離心機（湘儀，TD5A-WS）；流式細胞儀（美國BD，Becton Dickinson Facscalibour）； 倒 置 顯 微 鏡（ 日 本，Motic-AE31）；潔凈工作臺（上海博訊，SW-CJ-1F）；二氧化碳培養(yǎng)箱（上海博訊，HF151UV）；H-DMEM、胎牛血清（美國，Gibco）；MTT、0.01% PBS、0.25%胰蛋白酶+EDTA（美國，Hyclone）；LY294002、Ra-Pamycin（美國，Gene Operation）；FITC-Annexin V（寶靈曼公司）。

1.2 實驗分組及設計 將復蘇后的P3代生長狀態(tài)良好的BMECs細胞和培養(yǎng)至 P3 代的UC-MSCs分別按照1:2的比例接種于培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)，細胞總數(shù)為1×106/瓶，設單純 UC-MSCs和單純BMECs對照組，細胞總數(shù)為1×106/瓶。將BMECs細胞分別接種于4個培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶接種6.7×105個細胞，隨機選取其中2個培養(yǎng)瓶，在培養(yǎng)液中加入LY294002（50 μmol/mL），另外2個培養(yǎng)液內加入RAPA（50 nmol/mL），作用48 h，倒掉4個培養(yǎng)瓶內的培養(yǎng)液，用PBS沖洗2次，然后隨機選取1個加入LY294002的培養(yǎng)瓶和1個加入RAPA的培養(yǎng)瓶，分別接種3.3×105個UCMSCs，4個培養(yǎng)瓶內均加入5 mL完全培養(yǎng)基。7個試驗組分別為UC-MSCs組、BMECs組、共培養(yǎng)組、BMECs+LY294002組、BMECs+RAPA組、 共 培 養(yǎng)+LY294002組、共培養(yǎng)+RAPA組。均放置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 細胞凋亡檢測 懸浮細胞直接收集到10 mL的離心管中，每樣本細胞數(shù)為（1～5）×106/mL，500～1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用孵育緩沖液洗滌1次，500～1 000 r/min離心5 min，用100 μL的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育 10～15 min，500～1 000 r/min 離心5 min 沉淀細胞孵育緩沖液洗1次，加入熒光（SAFLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不時振動，流式細胞儀分析：流式細胞儀激發(fā)光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560 nm的濾器檢測PI。

1.4 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，使用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用單因素方差分析，用Duncan's進行多重比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 PI3K/Akt/mTOR信號通路對BMECs凋亡的調控作用 應用Annexin V/PI雙染法聯(lián)合流式細胞儀檢測各組細胞在72 h時的凋亡情況（每個試驗組重復3次，取平均值）。如表1所示，BMECS+LY294002組和BMECS+RAPA組的細胞凋亡率極顯著高于BMECs組（P＜0.01），說明當抑制劑阻斷 PI3K/Akt/mTOR信號通路時BMECs細胞凋亡率增加。

表1 抑制劑對BMECs凋亡的影響（n=3） %

2.2 UC-MSCs對PI3K/Akt/mTOR信號通路調控BMECs的影響 如表2所示，BMECs+LY294002組和BMECs+RAPA組的細胞凋亡率極顯著高于BMECs組和共培養(yǎng)組（P＜0.01）；BMECs+LY294002組的細胞凋亡率極顯著高于共培養(yǎng)+LY294002組（P＜0.01）；BMECs+RAPA組的細胞凋亡率極顯著高于共培養(yǎng)+RAPA組（P＜0.01），說明與UC-MSCs共培養(yǎng)能夠降低抑制劑對BMECs凋亡的影響。

表2 Annexin V/PI雙染法檢測各組細胞凋亡率（n=3） %

應用Annexin V/PI雙染法聯(lián)合流式細胞儀檢測各組細胞在72 h時的凋亡結果顯示（圖1），細胞分群明顯，明顯分開于4個象限中，說明用Annexin V/PI雙染法聯(lián)合流式細胞儀檢測各組細胞在72 h時的凋亡情況操作正確，結果可靠。

圖1 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況

3 討 論

3.1 UC-MSCs和BMECs共培養(yǎng)抑制BMECs凋亡 在本實驗中，將UC-MSCs和BMECs按照 1:2 濃度比混合共培養(yǎng)后，能夠明顯抑制BMECs細胞凋亡，說明UC-MSCs和BMECs共培養(yǎng)能夠抑制BMECs凋亡。研究表明，細胞凋亡普遍存在于機體細胞中，受多種因素調控，如激素和生長因子失衡，高溫、強酸、強堿等理化因素，抗癌藥物，免疫性因素，細菌、病毒等微生物學因素[11]。凋亡的抑制因素包括IL-2、神經(jīng)生長因子等細胞因子、某些激素、某些二價金屬陽離子、藥物等[12]。研究表明，UC-MSCs能夠抑制腫瘤壞死因子的分泌，而腫瘤壞死因子能誘導某些正常細胞凋亡，當機體處于炎癥等多種病理狀態(tài)下，體內腫瘤壞死因子合成和分泌增加，誘導細胞凋亡[13]。本實驗結果表明，與UC-MSCs共培養(yǎng)能夠抑制BMECs細胞凋亡，推測主要原因為UC-MSCs抑制了腫瘤壞死因子等促進細胞凋亡的生長因子的分泌，后期將進一步實驗證實。

3.2 UC-MSCs細胞通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制BMECs凋亡 本實驗中，將UC-MSCs和BMECs按照1:2的比例共培養(yǎng)，能夠抑制BMECs凋亡，但其作用機制尚不明確。為探究UC-MSCs抑制BMECs凋亡的具體機制，探討了PI3K/Akt/mTOR信號通路在其中所發(fā)揮作用。PI3K和Akt是抗細胞凋亡作用的重要調節(jié)因子，在調節(jié)多種細胞增殖、抑制細胞凋亡中發(fā)揮作用[14]。PI3K被激活后，可把底物PIP2轉化為PIP3，PIP3作為第二信使激活信號通路下游的眾多信號分子，可參與細胞的增殖、分化凋亡、存活和遷移等的信號傳遞[15]。Akt可調控多個與細胞凋亡有關的家族從而抑制細胞凋亡，例如可抑制Forkhead家族轉錄因子的活性，下調Fas/FasL誘導的凋亡過程[16]；抑制前凋亡蛋白BAD及caspase-9的活性，阻止其促凋亡作用[17]；正調節(jié)轉錄核因子NF-κB和bcl-2，從而抑制細胞凋亡[18]；上調IAPs（Inhibitor of Apoptosis Proteins，IAPs）的表達，發(fā)揮其抑凋亡作用[19]；也能通過磷酸化mTOR及其下游分子p70S6K、4E-BP1下傳生存信號，抑制不依賴p53的細胞凋亡，促進細胞生存[20]。因此，可以推測UC-MSCs可能通過旁分泌和自分泌作用分泌的細胞因子，激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，從而調控BMECs的凋亡。而PI3K和mTOR屬于PI3K/Akt/mTOR信號通路上、下游信號分子，為了驗證上述推測，本實驗設計用PI3K抑制劑LY294002和mTOR抑制劑RAPA孵育細胞，發(fā)現(xiàn)加入抑制劑LY294002和RAPA后，BMECs組凋亡率均顯著高于抑制劑處理前，說明PI3K/Akt/mTOR可能參與BMECs凋亡的抑制調控過程。值得一提的是，BMECs與UCMSCs共培養(yǎng)再加入PI3K抑制劑LY294002后凋亡率降低到5.79%，加入mTOR抑制劑RAPA的組凋亡率降低到5.87%，說明UC-MSCs不僅能夠激活PI3K，活化下游信號通路，同時能夠重新活化mTOR，即UCMSCs能夠再次激活被阻斷的PI3K/Akt/mTOR信號通路，或者可以說，UC-MSCs能夠“修復”PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制BMECs凋亡，使其重新參與到細胞的正常生命活動中去。

4 結 論

將UC-MSCs和BMECs按照1:2濃度比混合共培養(yǎng)，能夠抑制BMECs細胞凋亡，PI3K抑制劑LY294002和mTOR抑制劑RAPA孵育BMECs顯著提高了BMECs細胞凋亡率，與UC-MSCs共培養(yǎng)能夠消減抑制作用。

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