趙 濤 劉家驥

(重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院泌尿外科，重慶 402160)

微小RNA(miR)和老年前列腺癌有密切關系，參與腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展〔1～3〕。李明等〔1〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-183在老年前列腺癌中的表達水平顯著增高，且其增高水平與Gleason評分呈正相關關系〔4〕。但是關于miR-183在此方面的研究較少。本實驗擬分析miR-183在老年前列腺癌中的表達狀態(tài)及靶基因促紅細胞生成素產生肝細胞受體(EPH)A4對細胞遷移和侵襲的生物學作用。

1 材料與方法

1.1材料和試劑 由重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院提供經手術切除保留的12對老年前列腺癌組織和癌旁組織，切片均經過病理學鑒定。miR-183 mimics、miR-183、抗鏈球菌溶血素(AS)O、siRNA EPHA4購自上海吉瑪技術制藥有限公司。兔抗人EPHA4、羊抗兔二抗及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自中美合資博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和轉染 將老年前列腺癌細胞系PC3和LNCaP置于RPMI1064培養(yǎng)基及37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞進行下一步實驗。細胞每2～3 d換液或傳代1次。在轉染前24 h將對數(shù)期的細胞PC3和LNCaP接種到合適的孔板，并使其處于正常生長培養(yǎng)狀態(tài)(37℃、5%CO2)進行轉染。同時設立對照組。

1.2.2RNA提取和實時定量PCR(RT-PCR) 按照Trizol中的步驟提取PC3和LNCaP細胞中的總RNA，對RNA OD260和OD280使用紫外分光光度計進行測定，并計算其濃度。用特異的miR-183引物進行miRNA逆轉錄反應(RT)，同時以U6作為內參；OligodT作為通用引物進行基因EPHA4的RT，同時以β-actin作為內參。RT-PCR反應體系：cDNA 1 μl、引物各1 μl，2×SYBR Green Master Mix 10 μl，無菌蒸餾水7 μl。反應程序的設置如下：變性(95℃ 3 min)，然后95℃ 15 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s進行40個循環(huán)。

1.2.3細胞遷移和侵襲實驗 細胞遷移實驗：將轉染24 h后的細胞進行消化收集后，重懸于無血清培養(yǎng)基，種到Transwell的底部具有完全培養(yǎng)基小室內(3×104細胞/孔)。24 h后，將上層小室取出并穩(wěn)固10 min后磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，選用結晶紫最后染色30 min，然后PBS沖洗，將小室內的細胞用棉簽擦掉。細胞侵襲實驗：將100 μl Matrigel(終濃度為1 mg/ml)加入Transwell上層小室內，以垂直的方式，37℃培養(yǎng)4～5 h使其干成膠狀。其他步驟同細胞遷移實驗。

1.2.4miR-183基因的生物學預測方法 使用TargegtScan和miRanda網站對miR-183的靶基因進行預測，結合靶基因的選取的原則，將EPHA4作為候選靶基因。

1.2.5綠色熒光蛋白(GFP)熒光報告載體實驗 細胞同時轉染miR-183 mimics、miR-183 ASO和含有EPHA4 3′UTR、EPHA4 3′UTR mut的熒光報告載體及對照質粒。48 h后，用1倍PBS清洗，然后通過RIPA裂解液將細胞裂解，再來提取其內的蛋白。最后以RFP作為內參用測熒光的儀器測量熒光值。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1miR-183和EPHA4 mRNA在老年前列腺癌和癌旁組織中的表達 miR-183、EPHA4 mRNA在老年前列腺癌組織中的表達(4.72±0.28，3.22±0.18)顯著高于癌旁組織(1.00±0.18，1.00±0.10，P<0.01)。

2.2miR-183對老年前列腺癌細胞轉移能力的影響 遷移結果顯示，轉染miR-183 ASO組PC3、LNCaP細胞穿膜數(shù)目〔(77.3±8.3)個、(62.4±6.9)個〕顯著低于對照組〔(164.5±10.8)個、(141.2±11.5)個〕。侵襲實驗結果顯示，PC3、LNCaP細胞穿透膜的數(shù)目〔(67.3±9.6)個、(55.1±8.3)個〕明顯少于對照組〔(157.9±12.7)個、(147.8±11.2)個，均P<0.01〕，見圖1。

圖1 miR-183在PC3和LNCaP細胞侵襲和遷移中的作用情況(×200)

2.3miR-183基因的生物學方法預測及對其靶基因的驗證 圖2顯示在EPHA4的3′UTR上含有miR-183的結合位點。含EPHA4 3′UTR的熒光報告載體的熒光值通過miR-183過表達后增強，轉染 miR-183 ASO后含有EPHA43′UTR的熒光報告載體的熒光值減弱(P<0.01)；而將結合位點突變后，無論是過表達miR-183還是miR-183表達抑制對突變的報告載體的熒光值沒有影響，見圖3。RT-PCR結果顯示在PC3和LNCaP細胞內過表達miR-183、EPHA4 mRNA水平升高，轉染miR-183 ASO后，EPHA4 mRNA及蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，見圖4。

圖2 miR-183和EPHA4的結合位點及EPHA4突變的結合位點

圖3 GFP熒光報告載體實驗結果

圖4 RT-PCR結果

3 討 論

miRNA是比較保守的、內源性表達的小分子非編碼RNA，廣泛參與細胞生長、分化、凋亡甚至腫瘤的發(fā)生等細胞的生物學過程，在其中發(fā)揮了關鍵作用〔5〕。有研究顯示miR-183在老年前列腺癌中的含量升高〔1～3〕。有研究利用組織芯片檢測發(fā)現(xiàn)，miR-183在老年前列腺癌中是增高的，且發(fā)現(xiàn)隨著Gleason評分升高，miR-183表達水平也增高，而與在良性前列腺增生癥(BPH)的表達水平差異有統(tǒng)計學意義〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs let-7d，let-7g，miR-98，miR-96和miR-183的表達譜在一定水平上可以作為老年前列腺癌行為改變在生物學上的反應，可用于作為早期檢測的標志物〔6〕。本實驗結果提示miR-183在一定程度上可以顯著抑制老年前列腺癌細胞的轉移。

EPHA4是最大的受體酪氨酸激酶家族EPH的成員之一，EPH受體家族參與細胞的生長、增殖、分化、信號傳導、代謝及凋亡等一系列的生物變化，同時也參與一些心血管疾病、代謝性疾病及惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并發(fā)揮著極其有價值的生物學功能〔7〕。多項研究表明，EPH受體家族與腫瘤的發(fā)生和轉移有密切關系〔8～10〕。本實驗結果證明了miR-183可能通過靶定EPHA4來對老年前列腺癌癌細胞的轉移進行調控。

1李 明，張洪福，曹立宇，等.前列腺癌組織中4種microRNAs的表達及意義〔J〕.安徽醫(yī)科大學學報，2009；44(4)：443-6.

2Zhang QH，Sun HM，Zheng RZ，etal.Meta-analysis of microRNA-183 family expression in human cancer studies comparing cancer tissues with noncancerous tissues〔J〕.Gene，2013；527(1)：26-32.

3Mihelich BL，Khramtsova EA，Arva N，etal.miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells〔J〕.J Biol Chem，2011；286(52)：44503-11.

4李 明，尹 玉，曹立宇，等.微小RNA在前列腺癌組織中的表達及意義〔J〕.中國組織化學與細胞化學雜志，2008；17(6)：565-70.

5Griffiths-Jones S，Saini HK，van Dongen S，etal.miRBase：tools for microRNA genomics〔J〕.Nucleic Acids Res，2008;36：D154-8.

6尹 玉，李 明，李 昊，等.6種microRNAs在前列腺癌組織中的表達〔J〕.中華男科學雜志，2010；16(7)：599-605.

7Ueno K，Hirata H，Shahryari V，etal.microRNA-183 is an oncogene targeting Dkk-3 and SMAD4 in prostate cancer〔J〕.Br J Cancer，2013；108(8):1659-67.

8Nagano K，Kanasaki S，Yamashita T，etal.Expression of Eph receptor A10 is correlated with lymph node metastasis and stage progression in breast cancer patients〔J〕.Cancer Med，2013；2(6)：972-7.

9Chukkapalli S，Amessou M，Dilly AK，etal.Role of the EphB2 receptor in autophagy，apoptosis and invasion in human breast cancer cells〔J〕.Exp Cell Res，2014；320(2)：233-46.

10Li RX，Chen ZH，Chen ZK，etal.The role of EPH receptors in cancer-related epithelial-mesenchymal transition〔J〕.Chin J Cancer，2014；33(5)：231-40.